一种重组蛋白抗原、抗体及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组蛋白抗原、抗体及制备方法。所述重组蛋白抗原，其氨基酸序列如SEQ ID

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛋白抗原、抗体及制备方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种重组蛋白抗原，免疫该抗原的多克隆抗体，以及其制备方法。

技术介绍

[0002]Rab蛋白是小分子GTP结合蛋白家族中最大的亚家族，其作为囊泡运输的分子开关，在囊泡的形成、转运、粘附、锚定、融合等过程中均发挥作用。Rab32在许多组织都有表达，在动物肝脏内丰度较高，且参与线粒体、脂质合成，疾病发生等调控。目前的研究显示Rab32在猪脂肪细胞中很可能存在关键的调控作用，但机制不明，且Rab32在猪其他细胞中的功能研究也未见报道。目前国内市场中的没有针对猪的Rab32抗体，因此阻碍了对猪Rab32功能的深入研究。

技术实现思路

[0003]本专利技术目的在于提供一种重组蛋白抗原、抗体及制备方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
[0004]本专利技术提供一种重组蛋白抗原，其氨基酸序列如SEQ ID
№
.1所示。
[0005]上述重组蛋白具有与猪Rab32近似的抗原决定簇。以其作为抗原，通过动物免疫的方式可以快速、稳定地获得猪Rab32蛋白的多克隆抗体，从而为猪Rab32表达的研究工作提供技术支持。
[0006]根据本专利技术的另一个方面，提出了编码上述重组蛋白的基因序列。进一步，其核苷酸序列如SEQ ID
№
.2所示。
[0007]根据本专利技术的再一个方面，提出了包含上述基因序列的表达载体。
[0008]根据本专利技术的再一个方面，提出了包含上述基因序列或上述表达载体的宿主细胞。
[0009]一种多克隆抗体，由权利要求1所述重组蛋白通过动物免疫方法制得。
[0010]上述多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0011](1)首次免疫：用所述重组蛋白与弗氏完全佐剂混匀后进行注射；
[0012](2)加强免疫：用所述重组蛋白与弗氏不全佐剂混匀后进行注射；
[0013]每次免疫之间的间隔为10
‑
15天，最后一次免疫后采血制成猪Rab32多克隆抗体。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述加强免疫重复进行2
‑
3次。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述加强免疫进行3次，然后间隔7天采血进行间接ELISA检测抗血清效价。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，多克隆抗体的制备方法还包括步骤：
[0017](3)冲击免疫：用所述重组蛋白与生理盐水混匀后进行注射。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，免疫的动物为兔；优选地，为健康的雌性新西兰大白兔，4月龄。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：目前市场无针对猪Rab32的抗体，本专利技术填补了市场的空白。
附图说明
[0020]图1是多克隆抗体的Western blotting的结果图。
具体实施方式
[0021]下面将结合具体实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0022]实施例1，抗原处理
[0023]1‑
1.处理方式
[0024]初免抗原为重组蛋白与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化。
[0025]二免、三免、四免抗原为重组蛋白与等体积弗氏不完全佐剂混匀乳化。
[0026]五免冲击为重组蛋白与等体积生理盐水混合，冲击免疫。
[0027]1‑
2.动物免疫
[0028]动物选用健康雌性新西兰大白兔，4月龄，2.1kg。
[0029]免疫过程包括：
[0030]初免：第1天，免疫用抗原为弗氏完全佐剂与重组蛋白；
[0031]二免：第14天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂与重组蛋白；
[0032]三免：第28天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂与重组蛋白；
[0033]四免：第42天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂与重组蛋白；
[0034]四免后采血：第49天，耳静脉采血1mL，ELISA检测抗血清效价；
[0035]五免：第56天，免疫用抗原为生理盐水+重组蛋白。
[0036]1‑
3.间接ELISA检测
[0037]将抗原用0.05mol/L碳酸盐(PH＝9.6)稀释至6μg/mL，100μL/孔，4℃孵育过夜，实现包被抗原。然后取出用0.05％Tween
‑
20(PBST)洗涤三次，3分钟/次。再每孔加入含有5％脱脂奶粉(PBST)的封闭液150μL，37℃封闭120分钟。取出用0.05％Tween
‑
20(PBST)洗涤三次，3分钟/次。将抗血清分别按照1:1000稀释，然后倍比稀释，至1:512K，37℃孵育1小时。取出用0.05％Tween
‑
20(PBST)洗涤三次，3分钟/次。辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)。1:8000稀释，37℃孵育45分钟。取出用0.05％Tween
‑
20(PBST)洗涤五次，3分钟/次。加入底物溶液(TMB)100μL/孔，反应5
‑
10分钟，最后加入100μL2mol/L的硫酸终止反应。
[0038]1‑
4.测OD值
[0039]用酶标仪在450nm波长下测定OD值。
[0040]终放后抗血清效价检测的抗血清ELISA检测结果见表1。
[0041]表1
[0042]孔号阴性空白1K4K16K64K128KA0.0360.0932.7442.5072.0741.4330.892
B0.0420.0942.7162.4601.9551.3230.798
[0043]备注：A，B表示两只不同的兔子来源的血清。1K：抗血清稀释1000倍，4K：抗血清稀释4000倍，16K：抗血清稀释16000倍，64K：抗血清稀释64000倍，128K：抗血清稀释128000倍。判定血清效价标准：血清效价值≥2.5
×
阴性值。Rab32的终放后抗血清效价:R1≥128K，R2≥128K。
[0044]实施例2，抗体western blotting检测
[0045]Western blotting方法来验证Rab32抗体与抗原的结核，具体步骤如下：
[0046]1.方法：使用蛋白裂解液提取猪肝脏总蛋白，BCA法检测蛋白浓度后，调整浓度使之一致，样品混匀后，99℃，5min蛋白变性。设定蛋白上样量40μg。
[0047](1)制胶。玻璃板、固定架、梳子等用蒸馏水冲洗干净并晾干，固定玻璃板，根据凝胶试剂盒(PAGE凝胶制备试剂盒(10％)，EpiZyme)说明书配制分离胶及浓缩胶，分离胶位本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID
№
.1所示。2.编码权利要求1所述重组蛋白的基因序列。3.根据权利要求2所述的基因序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID
№
.2所示。4.包含权利要求2或3所述基因序列的表达载体。5.包含权利要求2或3所述基因序列或权利要求4所述表达载体的宿主细胞。6.一种多克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述重组蛋白通过动物免疫方法制得。7.权利要求6所述多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括步骤：(1)首次免疫：用所述重组蛋白与弗氏完全佐剂混匀后进行注射；(2)加强免疫：用所述重组蛋白与弗氏不全佐...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴杨莉，李奎，陈楚杰，李华，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：