发夹型单链RNA分子的制备方法技术

本发明专利技术涉及抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法，该制备方法包括下述的步骤：在脱水缩合剂的存在下，在包含缓冲液和亲水性有机溶剂的混合溶剂中，使下述式(I)所表示的第1单链寡RNA分子与下述式(II)所表示的第2单链寡RNA分子进行反应，5

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】发夹型单链RNA分子的制备方法


[0001]本专利技术涉及发夹型单链RNA分子的制备方法。

技术介绍

[0002]作为抑制基因表达的技术，例如已知有RNA干扰(RNAi) (非专利文献1)。在基于RNA干扰的基因表达抑制中，大多利用了使用被称为siRNA (小干扰RNA，small interferingRNA)的短的双链RNA分子的方法。另外，还报道了：使用通过分子内退火而部分地形成了双链的环状RNA分子的基因表达抑制技术(专利文献1)。
[0003]然而，由于siRNA在体内的稳定性低，容易解离成单链RNA，所以难以稳定地抑制基因表达。专利文献2报道了：利用使用氨基酸衍生物形成的1个或2个接头将siRNA的有义链和反义链连接成单链而得的发夹型单链长链RNA分子，可使siRNA稳定化。作为该单链长链RNA分子的制备方法，在专利文献2中记载了基于亚磷酰胺法的固相合成法。
[0004]作为长链DNA分子的制备方法，非专利文献2中报道了：将相对短链的2个寡DNA分子对、即分割成末端具有羧基的第1寡DNA分子和末端具有氨基的第2寡DNA分子的2个并合成，将它们在包含三嗪型脱水缩合剂的缓冲液中，通过酰胺化连接，由此进行制备的技术，但没有关于RNA分子的记载。
[0005]另一方面，例如，非专利文献3中报道了在水系溶剂中的酰胺化反应，但没有关于RNA分子的记载。
[0006]HATU被例示为：在固相合成时，在5
’
末端含有羧酸的低聚物的羧酸与标记物(例如菁蓝、氨基酸、肽之类的含氨基的物质)形成酰胺键时所使用的肽偶联剂(非专利文献4)。
[0007]现有技术文献专利文献专利文献1：美国专利申请公开第2004/058886号；专利文献2：国际公开WO2012/017919；非专利文献非专利文献1：Fire等人、Nature、1998年、第391卷、806
‑
811页；非专利文献2：Liu等人、Tetrahedron、2008年、第64卷、8417
‑
8422页；非专利文献3：Badland等人、Tetrahedron Letters、2017年、第58卷、4391
‑
4394页；非专利文献4：Guidebook for the Synthesis of Oligonucleotides Product Guide 2015/16、Link Technologies Ltd.、2017年、第58卷、49
‑
51页。

技术实现思路

[0008]专利技术所要解决的课题本专利技术的课题在于：提供抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的有效的制备方法。
[0009]用于解决课题的手段抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的以往的制备方法是利用亚磷酰胺法使核苷一个单元一个单元地延伸的方法，不能说是有效的方法。
[0010]于是，本专利技术人以开发抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的有效的制备方法为目的，将非专利文献2的合成技术应用于发夹型单链RNA分子的合成，但在RNA分子中由于存在很多在酰胺化反应中成为副反应的原因的羟基，因此生成大量杂质，显示出无法以高的收率得到目标物。
[0011]为了解决上述课题，本专利技术人反复进行了深入研究，结果发现了：在包含缓冲液和二甲基亚砜等亲水性有机溶剂的混合溶剂中，通过使用规定类型的脱水缩合剂，使2个单链寡RNA分子的末端进行酰胺化反应，能够以高的收率有效地制备发夹型单链RNA分子，从而完成了本专利技术。
[0012]在文献(Nuclear acid research、1990年、第391卷、4953页、基础分子生物学 第4版 田村等人著、2016年、东京化学同人等)中记载了二甲基亚砜等有机溶剂被用作核酸的变性剂，已知这样的有机溶剂使核酸的退火变得不稳定。考虑到这一点，本专利技术人发现的上述见解是令人惊讶的。
[0013]即，本专利技术包含以下内容。
[0014][1] 发夹型单链RNA分子的制备方法，其是抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法，包括下述的步骤：在脱水缩合剂的存在下，在包含缓冲液和亲水性有机溶剂的混合溶剂中，使下述式(I)所表示的第1单链寡RNA分子与下述式(II)所表示的第2单链寡RNA分子进行反应，5
’‑
Xc
‑
Lx
1 ・・・
(I)Lx2‑
X
‑
Y
‑
Ly
‑
Yc
‑3’ ・・・
(II)式(I)和式(II)中，X、Xc、Y和Yc由核糖核苷酸残基构成，Xc与X互补，Yc与Y互补，Ly为非核苷酸性接头，Lx1为具有氨基的非核苷酸性接头，Lx2为具有羧基的非核苷酸性接头，X
‑
Y包含针对上述靶基因的基因表达抑制序列，上述脱水缩合剂选自三嗪型脱水缩合剂、包含N
‑
羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂、碳二亚胺型脱水缩合剂、2
‑
卤代吡啶鎓型脱水缩合剂、和甲脒鎓型脱水缩合剂，在上述脱水缩合剂为碳二亚胺型脱水缩合剂的情况下，该脱水缩合剂与N
‑
羟基含氮芳香族化合物或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯组合使用，在上述脱水缩合剂为2
‑
卤代吡啶鎓型脱水缩合剂的情况下，该脱水缩合剂与N
‑
羟基含氮芳香族化合物组合使用，在上述脱水缩合剂为甲脒鎓型脱水缩合剂的情况下，该脱水缩合剂与N
‑
羟基含氮芳香族化合物或N
‑
烃取代咪唑衍生物组合使用。
[0015][2] [1]所述的制备方法，其中，上述接头Ly为具有氨基酸骨架或氨基醇骨架的非核苷酸性接头，上述接头Lx2为具有氨基酸骨架的非核苷酸性接头。
[0016][3] [1]或[2]所述的制备方法，其中，上述Ly为包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸性接头、或包含
‑
NHCH2COO
‑
的非核苷酸性接头，上述Lx2为包含具有羧基的吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸性接头、或包含
‑
NHCH2COOH的非核苷酸性接头。
[0017][4] [1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，Lx1由下述式(III)表示，Lx2由下述式(IV)或下述式(IV
’
)表示：[化学式1]・・・
(III)式(III)中，R1为可被取代的亚烷基链，
‑
OR1经由磷酸二酯键与Xc的3
’
末端结合，[化学式2]・・・
（(IV)ꢀ或ꢀ
・・・
(IV
’
)式(IV)中，R2为可被取代的亚烷基链，p为1或2，
‑
OR2经由磷酸二酯键与X的5
’
末端结合，式(IV
’
)中，R2为可被取代的亚烷基链，
‑
OR2经由磷酸二酯键与X本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.发夹型单链RNA分子的制备方法，其是抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法，包括下述的步骤：在脱水缩合剂的存在下，在包含缓冲液和亲水性有机溶剂的混合溶剂中，使下述式(I)所表示的第1单链寡RNA分子与下述式(II)所表示的第2单链寡RNA分子进行反应，5
’‑
Xc
‑
Lx
1 ・・・
(I)Lx2‑
X
‑
Y
‑
Ly
‑
Yc
‑3’ ・・・
(II)式(I)和式(II)中，X、Xc、Y和Yc由核糖核苷酸残基构成，Xc与X互补，Yc与Y互补，Ly为非核苷酸性接头，Lx1为具有氨基的非核苷酸性接头，Lx2为具有羧基的非核苷酸性接头，X
‑
Y包含针对上述靶基因的基因表达抑制序列，上述脱水缩合剂选自三嗪型脱水缩合剂、包含N
‑
羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂、碳二亚胺型脱水缩合剂、2
‑
卤代吡啶鎓型脱水缩合剂、和甲脒鎓型脱水缩合剂，在上述脱水缩合剂为碳二亚胺型脱水缩合剂的情况下，该脱水缩合剂与N
‑
羟基含氮芳香族化合物或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯组合使用，在上述脱水缩合剂为2
‑
卤代吡啶鎓型脱水缩合剂的情况下，该脱水缩合剂与N
‑
羟基含氮芳香族化合物组合使用，在上述脱水缩合剂为甲脒鎓型脱水缩合剂的情况下，该脱水缩合剂与N
‑
羟基含氮芳香族化合物或N
‑
烃取代咪唑衍生物组合使用。2.权利要求1所述的制备方法，其中，上述接头Ly为具有氨基酸骨架或氨基醇骨架的非核苷酸性接头，上述接头Lx2为具有氨基酸骨架的非核苷酸性接头。3.权利要求1或2所述的制备方法，其中，上述Ly为包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸性接头、或包含
‑
NHCH2COO
‑
的非核苷酸性接头，上述Lx2为包含具有羧基的吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸性接头、或包含
‑
NHCH2COOH的非核苷酸性接头。4.权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中，Lx1由下述式(III)表示，Lx2由下述式(IV)或下述式(IV
’
)表示，[化学式1]
・・・
(III)式(III)中，R1为可被取代的亚烷基链，
‑
OR1经由磷酸二酯键与Xc的3
’
末端结合，[化学式2]
・・・
(IV)ꢀ或ꢀ
・・・
(IV
’
)式(IV)中，R2为可被取代的亚烷基链，p为1或2，
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OR2经由磷酸二酯键与X的5
’
末端结合，式(IV
’
)中，R2为可被取代的亚烷基链，
‑
OR2经由磷酸二酯键与X的5
’
末端结合。5.权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，(i) 上述包含N
‑
羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂为苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂，
(ii) 上述N
‑
羟基含氮芳香族化合物为羟基苯并三唑或其衍生物，(iii) 上述氰基(羟基亚氨基)乙酸酯为氰基(羟基亚氨基)乙酸烷基酯，和/或(iv) 上述N
‑
烃取代咪唑衍生物为N
‑
烷基咪唑衍生物。6.权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其中，上述亲水性有机溶剂为亲水性的非质子性有机溶剂。7.权利要求6所述的制备方法，其中，上述亲水性的非质子性有机溶剂为二甲基亚砜、N,N
‑
二甲基甲酰胺、N,N
’‑
二甲基亚乙基脲、或乙腈。8.权利要求1～7中任一项所述的制备方法，其中，上述脱水缩合剂为4
‑
(4,6
‑
二甲氧基
‑
1,3,5
‑
三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉鎓氯化物、O
‑
(7
‑
氮杂苯并三唑
‑1‑
基)
‑
N,N,N
’

【专利技术属性】
技术研发人员：越本恭平，伊关克彦，稻田英朗，藤田达也，冲村庆一，国嶋崇隆，大木忠明，青木绘里子，
申请(专利权)人：东丽株式会社，
类型：发明
国别省市：