OsWRKY12及其在水稻磷高效育种中的应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程领域。具体的说，本发明专利技术涉及一种反向遗传学途径鉴定的水稻OsWRKY12基因，该基因在地上部受缺磷诱导，根部受缺磷先诱导后恢复，超表达该基因可以显著提高水稻对磷的吸收效率；本发明专利技术还涉及利用该基因产物提高水稻的磷吸收效率。本发明专利技术公开了一种调控水稻磷吸收的蛋白OsWRKY12其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所述，编码上述蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。NO:1所述。NO:1所述。

【技术实现步骤摘要】
OsWRKY12及其在水稻磷高效育种中的应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程领域。具体的说，本专利技术涉及一种反向遗传学途径鉴定的水稻OsWRKY12基因，该基因在地上部受缺磷诱导，根部受缺磷先诱导后恢复，超表达该基因可以显著提高水稻对磷的吸收效率；本专利技术还涉及利用该基因产物提高水稻的磷吸收效率。

技术介绍

[0002]磷(P)是植物正常生长发育所必需的大量营养元素之一，是ATP、磷脂、核酸等代谢物及生物大分子的重要组成部分，参与植物体内磷酸化、碳代谢等多种生化过程[1,2]。土壤中的无机磷大约占总磷的35％
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70％，但是很容易与钙以及铝、铁的氧化物、氢氧化物等形成难溶的复合物，因此能够被植物直接吸收利用的正磷酸盐(Pi,H2PO
4_
)是非常有限的[3]。2013年，农业部《中国三大粮食作物肥料利用率研究报告》指出，我国水稻、玉米、小麦三大粮食作物的磷肥当季平均利用率仅为24％。植物在长期的演化中进化出了多种策略利用土壤养分，以便其生存、生长和繁殖。水稻生产中磷肥利用率低，增加了成本和污染。因此，阐明水稻吸收磷的分子机理，通过遗传改良的方法提高作物的肥料利用效率，为科学、合理地使用化学肥料、节能减排提供理论基础，也是绿色农业的重大使命和必然要求。
[0003]为了应对低磷的生长环境，植物进化出多种策略，以高效吸收、利用土壤中的有效磷。土壤中有效磷的水平较低时，植物体内PSI(Pi
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starvation
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inducible)基因会诱导并分泌一系列磷酸水解酶，来释放根际环境中的有机磷[4]。磷酸水解酶分解有机磷基质释放的磷占土壤中全部无机磷的80％[5]。
[0004]此外，植物体通过整合外部及自身的磷的状况，形成复杂的磷调控网络。植物体内的生化响应途径主要包括两部分功能，通过增强磷酸酶的分泌、有机酸的释放来活化土壤中的有机磷，通过诱导高亲和性的磷酸盐转运体从而增强植物对磷的摄取能力[6]，以及通过新陈代谢层面的调控来适应缺磷[7]。
[0005]迄今为止，WRKY转录因子中与养分胁迫相关的报道还比较少。拟南芥中AtWRKY75是首个报道的与营养胁迫相关的WRKY转录因子。AtWRKY75的表达受到缺磷诱导，通过RNAi抑制AtWRKY75表达的拟南芥植株，相比于野生型，在生长发育早期出现花青素积累，表现为对缺磷更加敏感，同时抑制了植株体内许多缺磷响应基因的表达，包括IPS1以及高亲和性的磷转运体AtPHT1；1、AtPHT1；4，因此在缺磷时对磷的吸收减少。此外，RNAi株系的侧根长度、数量，以及根毛的数量都增加，表明，AtWRKY75可能同时参与调控根的发育[8]。缺磷情况下，根部AtWRKY45的表达被明显诱导，与AtWRKY75相同，AtWRKY45的RNAi株系同样表现为低磷敏感的表型。超表达AtWRKY45基因，能够同时诱导AtPHT1；1的表达，染色质免疫沉淀实验结果表明，AtWRKY45能够与AtPHT1；1中的W
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BOX结合，从而直接调控AtPHT1；1的表达，参与拟南芥的缺磷应答[9]。在磷充足的情况下，AtWRKY42能与PHO1结合，缺磷时AtWRKY42被降解，失去了结合能力，表明AtWRKY42通过控制PHO1调控磷的转运。AtWRKY42与AtPHT1；1的结合也是如此[10]。AtWRKY6也能通过与PHO1结合下调PHO1的表达，最近的研究表明，缺磷
NO:1所示的DNA序列。本专利技术中的SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列属于OsWRKY12，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID NO:1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本专利技术的目的。
[0030]本专利技术的另一个目的是提供一种用OsWRKY12基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本专利技术提供了具有SEQ ID NO:1所示的序列的基因片段的载体。
[0031]本专利技术还提供了一种利用植物表达载体转化植物提高磷吸收效率的方法。
[0032]本专利技术鉴定到一个参与调控水稻(Oryza sativa)磷平衡的WRKY转录因子OsWRKY12。该基因在地上部受缺磷诱导，并且随着缺磷时间增加，诱导倍数逐渐提高，在根部随着缺磷时间的增加，先诱导后降低到野生型水平；超表达OsWRKY12能够显著提高转基因水稻对磷的吸收效率。因此可以利用该基因通过基因工程技术提高水稻对磷的吸收利用效率。
[0033]实现本专利技术的具体技术步骤如下：
[0034]一、WRKY12在不同缺磷条件下表达模式
[0035]野生型水稻在正常营养液培养7天后，在缺磷营养液中培养0天、1天、3天、5天及7天，提取地上部和根部的总RNA，逆转录，进行荧光定量PCR。
[0036]二、发展超表达材料
[0037]通过构建OsWRKY12基因超表达载体，并进行水稻转基因，获得超表达材料。鉴定T1代超表达株系，进行无机磷含量的测定，确定磷表型。发现超表达OsWRKY12基因促进磷的吸收。
[0038]本专利技术实验结果证明：超表达OsWRKY12的株系，正常条件下苗期叶片有效磷比野生型高300％。
附图说明
[0039]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。
[0040]图1为WRKY12在不同缺磷条件下的表达模式；
[0041]野生型水稻在正常营养液培养7天后，在缺磷营养液中培养0天、1天、3天、5天及7天，提取叶片和根部的总RNA，逆转录，进行荧光定量PCR。数据为3次重复的平均数
±
SD，*表示相对于野生型存在显著差异(P<0.05,T
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Test)，**表示相对于野生型存在显著差异(P<0.01,T
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Test)，***表示相对于野生型存在显著差异(P<0.005,T
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Test)。
[0042]根据图1，可得知：在地上部WRKY12基因表达受缺磷诱导，随着缺磷时间的增加，诱导越强；在根部，WRKY12基因表达受缺磷先诱导后恢复。
[0043]图2为超表达OsWRKY12促进磷的吸收。
[0044]A.OsWRKY12超表达转基因材料T1代的鉴定。
[0045]B.野生型HJ2水稻以及35S
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1300
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OsWRKY12转基因材料T1代的8号、18号及19号株系在正常营养液(200μM Pi)条件下培养21天，地上部分剪取倒二叶，地下部分剪取新生的不定根，测定无机磷含量。*表示相对于野生型存在显著差异(P<0.05,T
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Test)，**表示相对于野生型存在显著差异(P<0.01,T
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Test)，***表示相对于野生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.调控水稻磷吸收的蛋白OsWRKY12，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO:2所述。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述氨基酸序列还包括在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。3.编码如权利要求1所述的蛋白或其功能类似物的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛传澡，毛文轩，徐纪明，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：