核酸是人体重要的遗传物质，在存储，复制和传递遗传信息中发挥重要作用，甲基化DNA是主要表观遗传学修饰方式之一，异常的DNA序列，碱基突变和表观遗传学变化常导致癌症的发生，为实现早期靶标检测，我们设计一个四面体辅助多串联发夹级联组装检测靶标（DNA/RNA/甲基化DNA等）的通用电化学传感器，孵育多个发夹级联组装触发信号扩增反应，电信号检测在RuHex溶液中实现，其强有力的静电吸引作用到DNA磷酸骨架上导致DPV电流响应增加。靶标检测线性浓度范围为10 aM至100 pM，最低检测限到1.78 aM。借助特异性酶切反应，在电化学平台上孵育甲基化DNA进行相关实验进一步证明该平台的优越性。越性。越性。
【技术实现步骤摘要】
基于四面体三脚架辅助的多发夹串级联组装构建通用型电化学生物传感器超灵敏检测靶
[0001]本专利技术涉及生物分析
，构建多个发夹逐渐串联组装在DNA四面体三脚架的电化学生物传感器检测核酸 DNA和DNA甲基化。
技术介绍
[0002]核酸作为人体的主要遗传物质，决定着生物分子，蛋白质和细胞成分的结构，并且在体内存储，调节和传递遗 传信息方面起着至关重要的作用。核酸的结构异常，基因碱基突变和染色体异常大大增加了癌症和疾病等的发 生率。DNA甲基化是主要的表观遗传学修饰方式之一，甲基基团在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化作用下与5
‑ꢀ
甲基胞嘧啶通过共价键结合，甲基化常发生在胞嘧啶
‑
磷酸
‑
鸟嘌呤位点(CpG岛)，表观遗传变化对于癌症的 早期诊断，预后和治疗起着至关重要的作用，有效的早期诊断将高度避免癌症和其他恶性肿瘤的发生，因此， 为了满足不断发展科学研究和临床需求，越来越多的超灵敏和超精确的DNA分子检测方法已在各个领域显得迫 在眉睫。
[0003]传统的核酸检测方法包括PCR，Southern Blot，基因分型，高分辨率熔解等，这些方法虽具有较高的优势， 却很容易造成假阳性信号的产生，且繁琐的实验程序和复杂的反应体系导致稳定性差，极大地阻碍了其更广泛 的临床应用。而光电化学生物传感器，荧光生物传感器，表面增强拉曼散射(SERS)，比色法也适用于检测DNA。 然而，经过许多参考文献的查阅学习和对相应靶标的详细探索和验证，具有更灵敏的检测，更简单的操作和更 低成本的电化学生物传感器被广泛应用于临床和其他研究领域中重要DNA分子标记物的检测，例如基于靶标诱 导的杂交链反应，分子标记反应，滚环扩增反应，链置换扩增反应等的靶标信号扩增反应技术等都是检测相应 靶标的有效方法。
[0004]利用电化学方法的优势，基于四面体三脚架的电化学生物传感器应运而生，借助一步等温多发夹串级联组装策 略快速检测目标DNA。四面体三脚架具有坚固的空间结构，极高的稳定性，可有效地提高目标DNA的捕获效率。 杂交链反应最早是由Dirks和Pierce于2004年提出的，杂交链反应将基于碱基互补配对的原理来产生长串联 DNA双链，并已广泛用于核酸检测的信号放大领域。
技术实现思路
[0005]基于之前单纯的双发夹组装仅通过简单的信号放大反应，在电极上孵育的四个发夹产生的串级联杂交联链，从 而增加了DPV信号物质的负载能力并增强DPV检测信号，实验操作非常简单，DPV信号物三氯化六铵合钌RuHex 在溶液中自由扩散，稳定存在使得检测结果稳定可重复。RuHex可以引起DNA磷酸骨架快速而有力的静态吸附， 从而导致电流增加，相应的电化学信号反映了在电极表面吸收的DNA分子的数量。在实验中用HpaⅡ甲基化限 制性核酸内切酶验证甲基化DNA的检测。甲基化的DNA最常出现在胞嘧啶
‑
磷酸
‑
鸟嘌呤位点(CpG)，因此拟议 的策略旨在捕获甲基化位点为5'
‑
CCGG
‑
3'的甲基化DNA，以更好地验证通
用电化学生物传感器的优越性，体现 靶标临床应用检测的意义。
[0006]具体的，本专利技术涉及以下技术方案：
[0007]首先专利技术涉及到的四面体三脚架为4条已设计好的互补碱基配对序列包括1条82碱基的长链和3条55个碱基 序列，并通过巯基稳定修饰在电极上。5
’
端到3
’
端序列依次是
[0008]四面体
‑
S1:ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATTTAAAGCTCGGCAGCTCCGGCCTGCG
[0009]四面体
‑
S2:SH
‑
C6
‑
TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC
[0010]四面体
‑
S3:SH
‑
C6
‑
TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC
[0011]四面体
‑
S4:SH
‑
C6
‑
TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTCTGTATTGGACCCTCGCAT
[0012]涉及到的靶DNA为含5'
‑
CCGG
‑
3'位点的DNA核酸序列为48碱基，5
’
端到3
’
端序列依次是
[0013]靶DNA:TCTCAAGGACCACCGCATCTCTACCGCAGGCCGGAGCTGCCGAGCTTT
[0014]涉及到的靶甲基化DNA：TCTCAAGGACCACCGCATCTCTACCGCAGGCCmGGAGCTGCCGAGCTTT
[0015]涉及到的4发夹包含靶DNA部分识别序列，5
’
端到3
’
端序列依次是
[0016]发夹H1:GTAGAGATGCGGTGGTCCTTGAGAGAATTCTTAACGTCGCCTCATACTGTCTCAAGGACCACCGCAT
[0017]发夹H2:TCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATGCGGTGGTCCTTGAGACAGTATGCCTAGCAGAGTT
[0018]发夹H3:TCGCCTCCTAGCAGAGTTACTTTGAAACTCTGCTAGGAGGCGACGTTAAGAATTC
[0019]发夹H4:TCAAAGTAACTCTGCTAGGAGGCGAGAATTCTTAACGTCGCCTCCTAGCAGAGTT
[0020][0021][0022]H1蓝色阴影部分与靶DNA蓝色阴影部分碱基互补配对，黄色阴影部分与H3黄色阴影部分碱基互补配对，H1斜 体下划线波浪部分为发夹杆部分，H2黑体加粗部分与H1碱基互补配对，H2灰色阴影部分为发夹杆部分，H2深 蓝色部分与H3深蓝色部分碱基互补配对，H3粉色加粗部分为发夹杆部分，H3与H4双波浪线斜体部分碱基互补 配对。H4黄色渐变斜体部分为发夹杆部分。
[0023]涉及到三氯化六铵合钌(RuHex)与4发夹串级联组装的多分支杂交链结合产生DPV电信号检测靶标，购自 Sigma
‑
Aldrich。
[0024]涉及到的HpaⅡ甲基化特异性内切酶1,000units，包括缓冲液，购自NEB北京生物公司。
[0025]涉及到的技术方案步骤如下：
[0026](a)TTs四条S链在含30mM TCEP巯基还原剂的TM反应缓冲液中放置1小时充分还原，后95℃5分钟一步合成1 μM四面本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.基于构建一种稳定坚固的四面体三脚架辅助于多发夹串级联组装杂交反应超灵敏的电化学生物传感器优于检测核酸DNA和甲基化DNA，其方法技术都将进行在后详细说明。2.根据权利要求1所述“四面体三脚架”3条55碱基链和82碱基长链通过高温变性稳定形成，3条链5
’
端修饰巯基，合成后TECP还原于电极上稳定修饰。3.根据权利要求1所述多发夹串级联组装的均匀溶液各单独发夹通过高温变性后置室温过夜稳定形成，序列有效设计为靶标存在时促发逐个发夹后形成多发夹级联杂交链。4.根据权利要求2所述四面体三脚架凸出顶端部分稳定识别捕获靶标，权利要求2所述发夹H1第一结构域在靶标存在时被催化打开，两者稳定杂交后顺利促发多发夹串级联杂交反应。5.同时靶标和四面体凸出端含5
’‑
CCGG
‑3’
结合后在Hpa
ꢀⅡ
酶识别验证DNA甲基化,靶标:5
’‑
TCTCAAGGACCACCGCATCTCTACCGCAGGCCGG AGCTGCCGAGCTTT
‑3’
；四面体三脚架:5
’‑
ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATTTAAAGCTCGGCAGCTCCGGCCTGCG
‑3’
。6.根据权利要求3所述4发夹杂交链串联组装，各发夹各部分的碱基互补配对部分层层级联反应形成树枝状杂交链，稳定于四面体支架，发夹H1:5
’‑
GTAGAGATGCGGTGGTCCTTGAGAGAATTCTTAACGTCGCCTCATACTGTCTCAAGGACCACCGCAT
‑3’
；发夹H2:5
’‑
TCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATGCGGTGGTCCTTGAGACAGTATGCCTAGCAGAGTT
‑3’
；发夹H3:5
’‑
TCGCCTCCTAGCAGAGTTACTTTGAAACTCTGCTAGGAGGCGACGTTAAGAATTC
‑3’
；发夹H4:5
’‑
TCAAAGTAACTCTGC...
【专利技术属性】
技术研发人员：易钢，黄玉麒，赵书慧，张文秀，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：
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