改进的核酸酶的组合物和方法技术

本披露提供了具有比野生型Cas9更快的降解速率的重组Cas9蛋白。本披露还提供了具有减少的脱靶修饰的重组Cas9蛋白和CRISPR

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的核酸酶的组合物和方法


[0001]本披露提供了具有比野生型Cas9更快的降解速率的重组Cas9蛋白。本披露还提供了具有减少的脱靶修饰的重组Cas9蛋白和CRISPR
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Cas系统。本文还提供了利用本披露的重组Cas9蛋白的、具有减少的脱靶修饰的位点特异性修饰的方法。

技术介绍

[0002]成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)系统是由Ishino在大肠杆菌中首次发现的、原核生物免疫系统(Ishino等人，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]169(12)：5429
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5433(1987))。该原核生物免疫系统通过以序列特异性方式靶向病毒和质粒的核酸来提供针对病毒和质粒的免疫。还参见Soret等人，Nature Reviews Microbiology[自然综述微生物学]6(3)：181
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186(2008)。CRISPR免疫应答涉及两个主要阶段：第一个是采集，第二个是干扰。采集阶段涉及切割入侵病毒和质粒的基因组，并将入侵病毒和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含工程化的KFERQ基序或KFERQ样基序的重组Cas9蛋白。2.如权利要求1所述的重组Cas9蛋白，其中该工程化的KFERQ基序或KFERQ样基序选自KFERQ(SEQ ID NO：24)、RKVEQ(SEQ ID NO：25)、QDLKF(SEQ ID NO：26)、QRFFE(SEQ ID NO：27)、NRVVD(SEQ ID NO：28)、QRDKV(SEQ ID NO：29)、QKILD(SEQ ID NO：30)、QKKEL(SEQ ID NO：31)、QFREL(SEQ ID NO：32)、IKLDQ(SEQ ID NO：33)、DVVRQ(SEQ ID NO：34)、QRIVE(SEQ ID NO：35)、VKELQ(SEQ ID NO：36)、QKVFD(SEQ ID NO：37)、QELLR(SEQ ID NO：38)、VDKLN(SEQ ID NO：39)、RIKEN(SEQ ID NO：40)、NKKFE(SEQ ID NO：41)及其组合。3.如权利要求1或2所述的重组Cas9蛋白，其中该工程化的KFERQ样基序是VDKLN(SEQ ID NO：39)。4.如权利要求1所述的重组Cas9蛋白，其中该工程化的KFERQ基序或KFERQ样基序在该Cas9蛋白的REC叶中。5.如权利要求2所述的重组Cas9蛋白，其中该工程化的KFERQ基序或KFERQ样基序在该REC叶的Rec2结构域中。6.如权利要求1所述的重组Cas9蛋白，其中该工程化的KFERQ基序或KFERQ样基序在该重组Cas9蛋白的HNH结构域、RuvC结构域或PI结构域中。7.如权利要求1至4中任一项所述的重组Cas9蛋白，其中该工程化的KFERQ基序或KFERQ样基序在该重组Cas9蛋白的表面暴露的区域中。8.如权利要求1至6中任一项所述的重组Cas9蛋白，其中该工程化的KFERQ基序或KFERQ样基序在该重组Cas9蛋白的N末端或C末端。9.一种包含野生型Cas9蛋白的一个或多个氨基酸修饰的重组Cas9蛋白，这些修饰将分子伴侣介导的自噬(CMA)靶基序或内体微自噬(eMI)靶基序引入该Cas9蛋白中，其中该重组Cas9蛋白在体内的降解比该野生型Cas9蛋白或不包含该CMA或eMI靶基序的Cas9蛋白快至少20％。10.如权利要求9所述的重组Cas9蛋白，其中该重组Cas9蛋白在体内的降解比该野生型Cas9蛋白或不包含该CMA或eMI靶基序的该Cas9蛋白快至少50％。11.如权利要求9或10所述的重组Cas9蛋白，其中该重组Cas9蛋白在体内的降解比该野生型Cas9蛋白或不包含该CMA或eMI靶基序的该Cas9蛋白快至少80％。12.一种包含野生型Cas9蛋白的一个或多个氨基酸修饰的重组Cas9蛋白，其中该重组Cas9蛋白包含CMA靶基序或eMI靶基序。13.如权利要求9至12中任一项所述的重组Cas9蛋白，其中该CMA靶基序或该eMI靶基序选自KFERQ(SEQ ID NO：24)、RKVEQ(SEQ ID NO：25)、QDLKF(SEQ ID NO：26)、QRFFE(SEQ ID NO：27)、NRVVD(SEQ ID NO：28)、QRDKV(SEQ ID NO：29)、QKILD(SEQ ID NO：30)、QKKEL(SEQ ID NO：31)、QFREL(SEQ ID NO：32)、IKLDQ(SEQ ID NO：33)、DVVRQ(SEQ ID NO：34)、QRIVE(SEQ ID NO：35)、VKELQ(SEQ ID NO：36)、QKVFD(SEQ ID NO：37)、QELLR(SEQ ID NO：38)、VDKLN(SEQ ID NO：39)、RIKEN(SEQ ID NO：40)、NKKFE(SEQ ID NO：41)及其组合。14.如权利要求13所述的重组Cas9蛋白，其中该CMA靶基序或该eMI靶基序是VDKLN(SEQ ID NO：39)。15.如权利要求9至14中任一项所述的重组Cas9蛋白，其中该一个或多个氨基酸取代位于该重组Cas9蛋白的表面暴露的区域中。
16.一种分离自酿脓链球菌的重组Cas9蛋白(SpCas9)，该重组Cas9蛋白在SEQ ID NO：1的位置F185、A547、I548、T560、V561、D829、I830、L1087、S1088、P1199、K1200或其组合中的一个或多个处包含氨基酸修饰。17.如权利要求9至16中任一项所述的重组Cas9蛋白，其中该氨基酸修饰包含以下突变中的一个或多个：(a)F185N；(b)A547E/I548L；(c)T560E/V561Q；(d)D829L/I830R；(e)L1087E/S1088Q；或(f)P1199D/K1200Q。18.如权利要求9至17中任一项所述的重组Cas9蛋白，其中该氨基酸修饰是F185处的突变。19.如权利要求18所述的重组Cas9蛋白，其中该突变是F185N。20.如权利要求16至19中任一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：AL，
申请(专利权)人：阿斯利康瑞典有限公司，
类型：发明
国别省市：