一种水中病毒的富集及检测方法技术

技术编号:28021543 阅读:23 留言:0更新日期:2021-04-09 23:00
本发明专利技术公开了一种水中病毒的富集及检测方法,包括向水中加入絮凝剂,同时调节水样pH值,混合、静置、过滤,将所获得胶体用磷酸盐缓冲液重悬,部分重悬液在组织研磨后进行核酸提取及定量PCR检测。本发明专利技术方法在富集过程中避免了二次加入有机或无机洗脱物质对后续操作过程的干扰,同时能够及时、高效地获得检测结果,不受水质水量的影响。而且本发明专利技术方法操作简单,不需要进行预处理,减少了预过滤过程造成的病毒损失;设备易得,试剂成本低,一次性投入少,处理时间短,具有广泛的适应性,适合推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种水中病毒的富集及检测方法
本专利技术涉及一种水中病毒的富集及检测方法,特别涉及污水中新型冠状病毒的富集及检测方法,属于生物分析测试和环境监测领域。
技术介绍
环境中存在的各种致病病毒对人类健康造成了极大的危害。目前已经证实,污水中含有多种不同种类的病毒,如诺如病毒、脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒、轮状病毒等等,这些病毒以水为媒介,经常引起传染病的爆发,因此有必要对其进行快速高效的检测,从而预防传染病大规模爆发流行。新冠疫情发生以来,许多地方已经在未经处理的污水和/或污泥中检测到SARS-CoV-2的RNA片段,例如意大利、西班牙、澳大利亚、荷兰、美国、法国等。有研究表明,在新冠病例确诊前4-7天可检测到SARS-CoV-2RNA浓度的变化,从而可以发出预警。相比于对人体的直接检测,检测污水厂进水中的病毒能够覆盖的人数更加广泛,包括不能及时进行人体检测或者未出现症状而不进行检测的感染者。因此,对污水中病毒尤其是新型冠状病毒的检测,是非常必要的,这可以为新冠疫情的爆发提供有效的预警,为公共卫生部门决定是否封锁城市争取宝贵的时间,从而有利于避免大范围传播和扩散。但是,水样体积巨大,其中病毒含量相对较少,现有的研究手段很难直接从水中检出病毒,因此在检测前先对水中的病毒进行富集就十分必要。病毒的富集不同于细菌,由于病毒颗粒直径较小,很难依靠机械阻留于膜上实现富集。世界各国各地学者及机构对如何实现水体中病毒的有效富集进行了大量探索,美国和欧盟也颁布了相应的指导性文件,如美国“水和废水检测标准方法”中的9510部分以及欧洲标准协会发布的BSEN14486-2005等。总结下来,对病毒的富集浓缩主要有以下几种方法:吸附洗脱法、絮凝沉淀法、免疫学法、超滤法、超速离心法、电泳法、反渗透等方法。尽管富集方法较多,但是却存在诸如操作复杂、价格昂贵、耗费时间较长、效果不稳定、易受到水质水量的影响、难以推广等许多问题。本专利技术能够实现对水中病毒的富集,之后采用研磨的方式将病毒从富集后的胶体中释放,再进行核酸提取及荧光定量PCR检测,操作简单、病毒回收率高,能够快速高效获得结果,避免了因方法耗费时间长而错过良好决策时机的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有水中病毒浓度检测过程中由于富集低浓度病毒存在的技术问题,提供一种水中病毒的富集及检测方法,本专利技术方法中病毒富集不受待测水体的水质水量的影响,病毒富集效率高,效果稳定,病毒浓度检测结果准确。为实现本专利技术的目的,本专利技术一方面提供一种水中病毒的富集方法,包括首先测定或/和调节水的pH;接着加入絮凝剂,对水中病毒进行絮凝处理;然后进行过滤处理,获得富集病毒。其中,所述病毒为新冠病毒、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(PORV)、禽流感病毒(AIV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)或猪圆环病毒(PCV),优选为猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、新冠病毒;所述水选择农村或城市生活污水、医院污水、畜禽养殖厂污水、屠宰污水、农贸市场污水、河,湖等自然水体或饮用水;所述调节水的pH为调节水的pH值为4-9,优选为5-7,进一步优选为6。若测定的水的pH值为4-9,则不需要进行pH调节;如果测定的水的pH值不在4-9之间,则添加pH调节剂,调整水的pH至4-9,优选为5-7,进一步优选为6。pH调节剂选盐酸或氢氧化钠溶液,优选为1M盐酸溶液或氢氧化钠溶液。特别是,所述絮凝剂选择铝盐絮凝剂,优选为氯化铝、硫酸铝、聚合氯化铝或聚合硫酸铝铁,优选为氯化铝。尤其是,加入絮凝剂后,水样中的絮凝剂铝离子浓度为0.001-0.01M,优选为0.001-0.003M,进一步优选为0.003M。本专利技术另一方面提供一种水中病毒的检测方法,包括如下顺序进行的步骤:1)向水中加入絮凝剂,接着加入pH调节剂,调整水的pH值为4-9,絮凝剂对水体中的病毒进行絮凝处理,获得絮凝混合液;2)对絮凝混合液进行过滤处理,并将过滤后的固体重新悬浮于缓冲溶液中,制得重悬混合液;3)对重悬混合液进行研磨处理,制得研磨液;4)对研磨液进行核酸提取,并进行核酸定量PCR测定。其中,步骤1)中所述絮凝剂为铝盐絮凝剂,优选为氯化铝、硫酸铝、聚合氯化铝或聚合硫酸铝铁,优选为氯化铝。特别是,加入絮凝剂后,水中的铝盐絮凝剂的铝离子浓度为0.001-0.01M,优选为0.001-0.003M,进一步优选为0.003M。特别是,加入絮凝剂之后,调节水的pH值为5-7,优选为6。特别是,在加入絮凝剂之前,还包括测定或/和调节水的pH值,在水的pH为4-9的条件下,加入所述的絮凝剂。尤其是,调节水的pH值为5-7,优选为6。其中,所述絮凝处理是将调节pH值后的水进行搅拌,絮凝剂与水液充分混合。特别是,絮凝处理时间至少15min,优选为15-20min。尤其是,将调节pH值后的水置于摇床中,在转速为100-200rpm的条件下混合至少15min,优选为15-20min。特别是,在向水中加入絮凝剂之前,还包括测定或/和调节水的pH值,使水的pH值为4-9,优选为pH为5-7,进一步优选为6。尤其是,在测定或调解水的pH值之前,还包括步骤1A),对水中病毒进行灭活处理。其中,选用巴氏消毒法进行所述的灭活处理。特别是,巴氏消毒法的温度为56-62℃,优选为60-62℃,进一步优选为60℃;消毒时间至少30min,优选为30-120min,进一步优选为30-90min,更进一步优选为30min。其中,步骤2)中所述的缓冲溶液选择PBS缓冲溶液、Tris-HCL缓冲液、HEPES缓冲液,优选为PBS缓冲液。特别是,所述PBS缓冲液的浓度为0.01M;pH为7.2-7.4。尤其是,所述缓冲溶液的浓度为0.01M;pH为7.2-7.4。特别是,还包括对过滤后的固体进行称重,获得絮凝处理后沉淀的固体的重量后再重新悬浮于缓冲溶液中。其中,如果固体重量≤1.5g时,则重悬缓冲溶液用量为1-5ml,优选为2-4ml,进一步优选为3ml;如果固体重量≥1.5g时,则重悬缓冲液用量按照公式(1B)来确定:y=a(x-1.5)+3(1B)公式(1B)中:y为重悬缓冲液的体积(ml);x为过滤后的固体的重量(g);a为比例系数,a=1-3,优选为2。特别是,在进行过滤处理之前,还包括将絮凝混合液进行静置处理至少15min,优选为15-30min,使得吸附于絮凝剂上的病毒,充分沉淀。尤其是,所述过滤处理为采用滤纸进行过滤,滤除上清液。特别是,过滤后的固体的含水率为78%-98%,优选为85-95%,进一步优选为89-95%。其中,步骤3)中所述研磨处理为采用研磨仪,在研磨频率为20-30Hz的条件下,对重悬混合液研磨3-15min,优选为本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种水中病毒的富集方法,其特征是,包括首先测定或/和调节水的pH,接着加入絮凝剂进行絮凝处理;然后进行过滤处理,获得富集病毒。/n

【技术特征摘要】
1.一种水中病毒的富集方法,其特征是,包括首先测定或/和调节水的pH,接着加入絮凝剂进行絮凝处理;然后进行过滤处理,获得富集病毒。


2.如权利要求1所述的方法,其特征是,所述调节水的pH值为4-9,优选为6。


3.如权利要求1或2所述的方法,其特征是,所述絮凝剂为铝盐絮凝剂。


4.一种水中病毒的检测方法,其特征是,包括如下顺序进行的步骤:
1)向水中加入絮凝剂,接着加入pH调节剂,调整水的pH值为4-9,絮凝剂对水体中的病毒进行絮凝处理,获得絮凝混合液;
2)对絮凝混合液进行过滤处理,并将过滤后的固体重新悬浮于缓冲溶液中,制得重悬混合液;
3)对重悬混合液进行研磨处理,制得研磨液;
4)对研磨液进行核酸提取,并进行核酸定量PCR测定。


5.如权利要求4所述的方法,其特征是,所述水选择农村或城市生活污水、医院污水...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨敏于丽娜田哲张昱
申请(专利权)人:中国科学院生态环境研究中心
类型:发明
国别省市:北京;11

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