一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术公开的一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法，通过CRISPR/Cas9技术对玉米ZmGA3ox1基因进行基因编辑，并进一步筛选获得目的基因功能缺失的突变体材料，这些玉米矮化材料具有重要的育种价值。

【技术实现步骤摘要】
一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法
本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法。
技术介绍
二十世纪玉米产量的提高主要依赖提高单位面积内玉米的种植密度，但是密度过高随之而来的就是倒伏的风险，可能会降低产量，因此在一定程度上降低玉米株高有助于提高玉米产量。上世纪60年代末，闻名于世的“绿色革命”掀起了半矮化植株可以提高产量的狂潮。在“绿色革命”期间成功创制了半矮化水稻和小麦的高产品种。在过去的几十年中许多玉米矮化突变体被鉴定，但没有完全应用到玉米育种中。传统矮杆玉米的创制主要是通过回交转育的方法，往往需要经过6个回交世代，不仅耗时长，同时经常伴随基因冗余，导致一些非目标性状的导入，限制了改良材料的应用效果。赤霉素(GAs)是一种天然的四环二萜羧酸，在植物种子萌发、茎的伸长以及花的形成等生长发育过程中起着重要的作用。目前发现的赤霉素种类已经有130多种，其中有活性的赤霉素有四种，分别是GA1、GA3、GA4和GA7。在植物体内GA有两种存在形式，一种以游离态形式存在，参与植物生长代谢途径，另一种以结合态的形式存在，是不具有活性的，植物体内GA正常的含量由结合态GA与游离态GA的动态平衡来维持。GA的生物合成包括以下几个步骤：1)在原生质体中牻牛儿基二磷酸合成内根-贝壳杉烯；2)在内质网上内根-贝壳杉烯氧化生成GA12，GA12进一步转化成GA53；3)GA12和GA53进入到细胞质中，在一系列赤霉素氧化酶的作用下生成有活性的GA分子。因此，提供一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)针对基因ZmGA3ox1设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA作用位点；所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为：5’-GGGTTCTTGTTGAGGTGCGACGG-3’；SEQIDNO.3；和5’-GAAGCTGGTGTAGTCGTCGCCGG-3’；SEQIDNO.4；(2)以pCBC-MT1T2质粒为模板，MT1T2-F，MT1T2-F0，MT2T2-R0，MT2T2-R为引物，PCR扩增目的片段；所述引物序列如下：MT1T2-F：5’-AATAATGGTCTCAGGCGGGTTCTTGTTGAGGTGCGA-3’；SEQIDNO.5；MT1T2-F0：5’-GGGTTCTTGTTGAGGTGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；SEQIDNO.6；MT1T2-R0：5’-GCGACGACTACACCAGCTTCGCTTCTTGGTGCC-3’；SEQIDNO.7；MT1T2-R：5’-ATTATTGGTCTCTAAACGCGACGACTACACCAGCTT-3’；SEQIDNO.8；所述PCR反应体系为：pCBC-MT1T2质粒1μl，MT1T2-F0.5μl，MT1T2-F00.5μl，MT1T2-R00.5μl，MT1T2-R0.5μl，2×Mix10μl，ddH2O7μl；PCR扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。(3)将步骤(2)获得的目的片段与载体pBUE411进行酶切连接，构建得到ZmGA3ox1基因编辑载体pBUE411-2gR-ZmGA3ox1；所述酶切连接反应体系如下：目的片段2μl，pBUE4112μl，10xNEBT4Buffer1.5μl，10xBSA1.5μl，BsaI1μl，T4Ligase1μl，ddH2O6μl，Total15μl；(4)将步骤(3)获得的基因编辑载体pBUE411-2gR-ZmGA3ox1转入农杆菌LBA4404，进行玉米遗传转化，经筛选鉴定获得玉米矮化材料。将两个sgRNA作用位点通过不同表达盒串联到同一基因编辑载体上。携带Cas9的载体为pBUE411。所述玉米为自交系C01。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法，基因编辑技术能精准对目的基因进行编辑，并且没有外缘基因的导入，本专利技术通过基因编辑技术精准编辑赤霉素合成基因ZmGA3ox1，可以精准降低玉米株高，并且不改变其它农艺性状。本专利技术首次揭示了玉米ZmGA3ox1基因的生物学功能，通过CRISPR/Cas9技术对玉米ZmGA3ox1基因进行基因编辑，并进一步筛选获得目的基因功能缺失的突变体材料，这些玉米矮化材料具有重要的育种价值。本专利技术创制的玉米矮化材料属于高度矮化材料，节间发育变短但正常结实，通过合理的栽培管理措施可以应用于杂交玉米生产。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术测序比对结果；图2附图为本专利技术突变体株系；其中，A为野生型玉米植株；B为突变体玉米植株。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术利用基因编辑技术创制玉米矮化材料，针对玉米中的目标基因ZmGA3ox1设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带Cas9的载体中，用构建的载体转化玉米(如农杆菌介导法)，实现对基因ZmGA3ox1的定点突变，进而获得ZmGA3ox1基因功能缺失的玉米植株。实施例1基因编辑载体的构建(1)控制玉米株高的基因为ZmGA3ox1基因，其核苷酸序列如下：ATGCCGACGCCGTCGCACCTCAACAAGAACCCGCGCTACCTGGACTTCCGGGCGGCGCGGCGGGTGCCGGAGTCGCACGCCTGGCCGGGCCTGCACGACCACCCCGTCGTGGACGGCGGCGCGCCGGGCCCCGACGCCGTGCCGGTGGTGGACCTGGGCGCCGCGGACCCGGCGCCGGCGCCGGCGGCGGCGGTGGCCCGCGCCGCCGAGCAATGGGGCGCGTTCCTGCTCACGGGCCACGGCGTCCCCGCGGACCTGCTGGCGCGCGTGGAGGACCGGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法，其特征在于，具体步骤如下：/n(1)针对基因ZmGA3ox1设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA作用位点；/n所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为：/n5’-GGGTTCTTGTTGAGGTGCGACGG-3’；SEQ ID NO.3；和/n5’-GAAGCTGGTGTAGTCGTCGCCGG-3’；SEQ ID NO.4；/n(2)以pCBC-MT1T2质粒为模板，MT1T2-F，MT1T2-F0，MT2T2-R0，MT2T2-R为引物，PCR扩增目的片段；/n所述引物序列如下：/nMT1T2-F：5’-AATAATGGTCTCAGGCGGGTTCTTGTTGAGGTGCGA-3’；SEQ ID NO.5；/nMT1T2-F0：5’-GGGTTCTTGTTGAGGTGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；SEQ ID NO.6；/nMT1T2-R0：5’-GCGACGACTACACCAGCTTCGCTTCTTGGTGCC-3’；SEQ ID NO.7；/nMT1T2-R：5’-ATTATTGGTCTCTAAACGCGACGACTACACCAGCTT-3’；SEQ ID NO.8；/n(3)将步骤(2)获得的目的片段与载体pBUE411进行酶切连接，构建得到ZmGA3ox1基因编辑载体pBUE411-2gR-ZmGA3ox1；/n所述酶切连接反应体系如下：目的片段2μl，pBUE4112μl，10xNEB T4Buffer 1.5μl，10xBSA 1.5μl，BsaI 1μl，T4 Ligase 1μl，ddH...

【技术特征摘要】
1.一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)针对基因ZmGA3ox1设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA作用位点；
所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为：
5’-GGGTTCTTGTTGAGGTGCGACGG-3’；SEQIDNO.3；和
5’-GAAGCTGGTGTAGTCGTCGCCGG-3’；SEQIDNO.4；
(2)以pCBC-MT1T2质粒为模板，MT1T2-F，MT1T2-F0，MT2T2-R0，MT2T2-R为引物，PCR扩增目的片段；
所述引物序列如下：
MT1T2-F：5’-AATAATGGTCTCAGGCGGGTTCTTGTTGAGGTGCGA-3’；SEQIDNO.5；
MT1T2-F0：5’-GGGTTCTTGTTGAGGTGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；SEQIDNO.6；
MT1T2-R0：5’-GCGACGACTACACCAGCTTCGCTTCTTGGTGCC-3’；SEQIDNO.7；
MT1T2-R：5’-ATTATTGGTCTCTAAACG...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋广树，吕庆雪，李毅丹，孙蕾，高嵩，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：吉林;22