一种pH敏感的抗氧化纳米载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种pH敏感的抗氧化纳米载体的其制备方法，包括以下步骤：(1)将壳聚糖溶解在蒸馏水中，得到壳聚糖溶液；(2)将N‑乙酰‑L‑组氨酸完全溶解在二甲基亚砜中，然后加入N,N'二咪唑；搅拌后将溶液蒸发干，加入壳聚糖溶液搅拌，透析后冷冻干燥得到N‑乙酰‑L‑组氨酸接枝的壳聚糖；(3)取EDC和NHS偶联剂，搅拌均匀后加入N‑乙酰半胱氨酸，得到羧基活化的N‑乙酰半胱氨酸；(4)将N‑乙酰‑L‑组氨酸接枝的壳聚糖和羧基活化的N‑乙酰半胱氨酸混合后加入到TEMED/HCI缓冲溶液中；在磁力搅拌下反应6‑10h，然后应用透析袋透析，再冷冻干燥处理得到pH敏感的抗氧化纳米载体。本发明专利技术制得的抗氧化纳米载体能促进干细胞存活，并高效的在酸性微环境中靶向传递、释放药物。

【技术实现步骤摘要】
一种pH敏感的抗氧化纳米载体及其制备方法和应用
本专利技术涉及
，更具体地说，它涉及一种pH敏感的抗氧化纳米载体及其制备方法和应用。
技术介绍
骨髓间充质干细胞在骨损伤修复中的应用具有很重要的价值。然而，外伤、手术等原因所致的骨缺损会在不同程度上，破坏骨缺损区的血液供应，致使骨缺损区处于相对缺血缺氧的状态，同时又由于局部的炎症微环境，代谢产物堆积等多种因素均会导致移植的干细胞成活率下降，严重限制了骨髓间充质干细胞在骨损伤修复中所发挥的重要作用。因此，在骨损伤修复中如何促进移植的干细胞在支架中生存，提高其抗氧化损伤、抗凋亡能力，充分发挥其成骨分化的潜能至关重要。研究证明，当间充质干细胞移植于骨缺损处或心肌、肾脏及脑的梗死区域后，会因局部的缺血缺氧及炎症微环境而发生氧化应激，使细胞内活性氧自由基(ROS)产生增加，进而促进Bax表达上调，抑制Bcl-2的表达，引起线粒体通透性转化孔(MPTP)开放，跨膜电位降低，细胞色素C(cyto-c)以及凋亡诱导因子(AIF)释放，最终激活下游的Caspase-9及Caspase-3而诱导移植的干细胞发生凋亡。在此过程中，活性氧(ROS)作为一类具有氧化能力的离子、分子和自由基，是细胞线粒体凋亡通路中的重要中介。因此，可通过清除细胞内ROS的方式来提高移植的干细胞在缺血缺氧局部环境中的抗凋亡能力。在近几年的研究中，一些学者通过利用白藜芦醇、绿茶提取物、香草素、褪黑素、七氟、高密度脂蛋白、番茄红素、维生素E等抗氧化剂来清除细胞内的ROS，结果均证实清除细胞内的ROS能够明显提高支架中间充质干细胞在局部缺血缺氧，炎症微环境中的抗凋亡能力。由此可见，抗氧化剂的应用在促进骨损伤修复中发挥着较大的作用。在众多抗氧化剂中，N-乙酰-L-半胱氨酸(NACC)是一种抗氧化性能较强的氨基酸，被ZafarullahM称为是细胞内ROS的清道夫，可通过其活性巯基直接清除嗜电子反应物如H2O2、·OH、·O2-等ROS自由基，同时NACC脱乙酰基后生成的半胱氨酸又能够促进体内抗氧化物质谷胱甘肽的合成。目前骨组织工程依然面临由于局部的缺血缺氧酸性微环境，代谢产物堆积等多种因素均会导致的移植的干细胞成活率低，从而严重影响了骨缺损修复的效能。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种pH敏感的抗氧化纳米载体的制备方法，制得的抗氧化纳米载体能促进干细胞存活，并高效的在酸性微环境中靶向传递、释放药物。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种pH敏感的抗氧化纳米载体的制备方法，包括以下步骤：(1)将壳聚糖溶解在蒸馏水中，得到壳聚糖溶液；(2)将N-乙酰-L-组氨酸完全溶解在二甲基亚砜中，然后加入N,N'二咪唑；搅拌后将溶液蒸发干，加入壳聚糖溶液继续搅拌，透析后冷冻干燥得到N-乙酰-L-组氨酸接枝的壳聚糖；(3)取EDC和NHS偶联剂，搅拌均匀后，加入N-乙酰半胱氨酸，得到羧基活化的N-乙酰半胱氨酸；(4)将N-乙酰-L-组氨酸接枝的壳聚糖和羧基活化的N-乙酰半胱氨酸混合后加入到TEMED/HCI缓冲溶液中；在磁力搅拌下连续反应6-10h，然后应用透析袋透析，再冷冻干燥处理得到pH敏感的抗氧化纳米载体。进一步地，所述步骤(1)中，壳聚糖溶液的浓度为5.75mg/mL。进一步地，所述步骤(2)中，N-乙酰-L-组氨酸与N,N'二咪唑的质量比为(490-495)mg:(1.60-1.65)g。进一步地，所述步骤(4)中，TEMED/HCI缓冲溶液的pH值为4.5-5.0。进一步地，所述步骤(4)中，透析袋的截留分子量为8000。本专利技术的另一目的是提供一种由上述制备方法制得的pH敏感的抗氧化纳米载体。本专利技术还提供了上述pH敏感的抗氧化纳米载体的应用，将pH敏感的抗氧化纳米载体溶解在蒸馏水中，再用乙醇稀释，加入BMP-2，在38-42℃旋转蒸发得到薄膜，加入蒸馏水后搅拌完全，通过微孔过滤器过滤后，冷冻干燥得到含BMP-2的抗氧化纳米粒子。进一步地，所述微孔过滤器的过滤精度为0.45um。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术制得的pH敏感的抗氧化纳米载体是由N-乙酰半胱氨酸及N-乙酰-L组氨酸共修饰的载基因壳聚糖纳米微粒，能促进干细胞存活，并高效的在酸性微环境中靶向传递、释放药物。2.本专利技术选用的N-乙酰半胱氨酸中含有羧基，先通过EDC及NHS将羧基活化，进而通过活化的羧基与壳聚糖的胺基共价形成酰胺键，并通过N,N'二咪唑偶联反应将pH敏感的N-乙酰基-L-组氨酸接枝到壳聚糖上，从而达到稳定接枝的效果。3.本专利技术制得的抗氧化纳米粒子既能感受细胞内外酸性pH达到靶向释放的目的，又能稳定线粒体膜电位，降低细胞内活性氧水平，促进干细胞的生存，以提高传递效率，增强干细胞的成骨分化，提高骨缺损修复效能。附图说明图1是本专利技术中含BMP-2的抗氧化纳米粒子的结构示意图。具体实施方式为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。一种pH敏感的抗氧化纳米载体，由以下步骤制得：(1)将115mg壳聚糖溶解在20ml蒸馏水中，得到浓度为5.75mg/mL的壳聚糖溶液；(2)将493毫克N-乙酰-L-组氨酸溶解在10毫升二甲基亚砜中，然后加1.62克N,N'二咪唑；搅拌4小时将溶液蒸发干，然后加入壳聚糖溶液，继续搅拌12小时；用蒸馏水透析3天后，将其冷冻干燥得到N-乙酰-L-组氨酸接枝的壳聚糖；(3)取EDC和NHS偶联剂，搅拌均匀后，加入30mgN-乙酰半胱氨酸；得到羧基活化的N-乙酰半胱氨酸；(4)将N-乙酰-L-组氨酸接枝的壳聚糖和羧基活化的N-乙酰半胱氨酸混合后加入到pH为4.5-5.0的TEMED/HCI缓冲溶液中；在磁力搅拌下连续反应6-10h，然后用截留分子量为8000的透析袋透析，再冷冻干燥处理得到pH敏感的抗氧化纳米载体；通过抗氧化纳米载体制备含BMP-2的抗氧化纳米粒子，其制备方法如下：将pH敏感的抗氧化纳米载体(10mg)溶解在蒸馏水(1mL)中，再用乙醇(2mL)稀释，加入(1mg)BMP-2，在40℃旋转蒸发得到薄膜，加入(10mL)蒸馏水后搅拌完全，通过0.45um的微孔过滤器过滤后，冷冻干燥得到含BMP-2的抗氧化纳米粒子。其结构示意图如图1所示。本专利技术制备得到的抗氧化纳米粒子既能感受细胞内外酸性pH达到靶向释放的目的，又能稳定线粒体膜电位，降低细胞内活性氧水平，促进干细胞的生存，以提高传递效率，增强干细胞的成骨分化，提高骨缺损修复本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种pH敏感的抗氧化纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将壳聚糖溶解在蒸馏水中，得到壳聚糖溶液；/n(2)将N-乙酰-L-组氨酸完全溶解在二甲基亚砜中，然后加入N,N'二咪唑；搅拌后将溶液蒸发干，加入壳聚糖溶液继续搅拌，透析后冷冻干燥得到N-乙酰-L-组氨酸接枝的壳聚糖；/n(3)取EDC和NHS偶联剂，搅拌均匀后，加入N-乙酰半胱氨酸，得到羧基活化的N-乙酰半胱氨酸；/n(4)将N-乙酰-L-组氨酸接枝的壳聚糖和羧基活化的N-乙酰半胱氨酸混合后加入到TEMED/HCI缓冲溶液中；在磁力搅拌下连续反应6-10h，然后应用透析袋透析，再冷冻干燥处理得到pH敏感的抗氧化纳米载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种pH敏感的抗氧化纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶解在蒸馏水中，得到壳聚糖溶液；
(2)将N-乙酰-L-组氨酸完全溶解在二甲基亚砜中，然后加入N,N'二咪唑；搅拌后将溶液蒸发干，加入壳聚糖溶液继续搅拌，透析后冷冻干燥得到N-乙酰-L-组氨酸接枝的壳聚糖；
(3)取EDC和NHS偶联剂，搅拌均匀后，加入N-乙酰半胱氨酸，得到羧基活化的N-乙酰半胱氨酸；
(4)将N-乙酰-L-组氨酸接枝的壳聚糖和羧基活化的N-乙酰半胱氨酸混合后加入到TEMED/HCI缓冲溶液中；在磁力搅拌下连续反应6-10h，然后应用透析袋透析，再冷冻干燥处理得到pH敏感的抗氧化纳米载体。


2.根据权利要求1所述的pH敏感的抗氧化纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，壳聚糖溶液的浓度为5.75mg/mL。


3.根据权利要求1所述的pH敏感的抗氧化纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，N-乙酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：闵少雄，张国炜，于滨生，黄永灿，李鑫，仇显帅，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：广东;44