本发明专利技术提供了一种同时检测血清中3种雌激素的化学衍生‑超高效液相色谱‑串联质谱法，采用一种新型衍生化试剂3‑甲基‑8‑喹啉磺酰氯对目标雌激素分析物进行化学衍生后，用于超高效液相色谱‑串联质谱检测。本发明专利技术所提供的方法采用3‑甲基‑8‑喹啉磺酰氯对雌激素的酚羟基特异性衍生化，通过衍生化反应将质子化的带电荷基团引入目标雌激素分析物中，雌激素衍生物的pKa值增加，增强了离子化效率，提高了雌激素质谱检测的灵敏度；通过优化色谱条件，减少同分异构体共流出，降低基质干扰，提高了本方法定量的特异性、准确性和灵敏度；本方法具有操作简单、反应时间短、灵敏度高且无交叉污染、衍生产物稳定且衍生化试剂廉价易得的优势。
【技术实现步骤摘要】
同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法
本专利技术涉及医疗分析检测
，更具体地，涉及一种同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法。
技术介绍
雌激素属于类固醇激素，大部分的雌激素是由雄激素受芳香化酶催化而来，其主要以雌酮(E1)、雌二醇(E2)和雌三醇(E3)等形式存在。雌激素是女性重要的性激素，其在促进和维持女性生殖器官和第二性征方面起着至关重要的作用，同时对人体的新陈代谢、骨骼的生长和成熟、内分泌系统、网状内皮系统、心血管系统以及皮肤等方面也有很的大影响。在现有技术中，提高LC-MS/MS检测灵敏度的手段主要有柱前衍生化，普遍使用丹磺酰氯作为衍生化试剂。2017年，SiqueiraFerreira等人发表的题为《HighsensitivitymethodvalidatedtoquantifyestradiolinhumanplasmabyLC-MS/MS》的论文中，检测血浆中单一化合物雌二醇的线性范围为2-150pg/mL，但是衍生化过程需要两次液-液萃取且存在特异性不足等缺点；此外，采用对氟磺酸2-氟-1-甲基吡啶鎓(FMP)进行衍生化后，会生成很多干扰的副产物。李迎发表的题为《基于衍生化与LC-MSn联用研究生物样品中难测定药物的定量测定及其在药代动力学中的应用》的论文中将化学衍生与亲水作用色谱技术结合，以避免基质干扰物与目标衍生产物的共流出，但是其检测价格昂贵，实际应用前景欠佳。综上所述，研究开发一种操作简便、反应时间短、灵敏度高、衍生产物稳定且衍生化试剂廉价易得的定量检测血清中雌激素的方法是本领域技术人员亟需解决的关键技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，该方法具有前处理简单，灵敏度高，检测速度快，准确度高，成本低的优点。本专利技术采用如下技术方案：一种同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，所述3种雌激素为雌酮、雌二醇和雌三醇；具体包括如下步骤：S1、将待测血清样品与稳定同位素内标溶液混匀后，通过液-液萃取提取目标激素；S2、采用3-甲基-8-喹啉磺酰氯进行衍生化反应；S3、采用超高效液相色谱-串联质谱技术对所述衍生化反应后的待测液进行检测。详细地，在上述技术方案中，采用3-甲基喹啉-8-磺酰氯标记雌激素后，通过改变衍生产物的pKa值，通过衍生化反应将质子化的带电荷基团引入3种目标雌激素分析物中，雌激素衍生化产物的pKa值至4.83，增强了待测物的离子化效率，提高了雌激素质谱检测的灵敏度。具体地，在上述技术方案中，步骤S2中，通过加入3-甲基喹啉-8-磺酰氯的丙酮溶液进行衍生化反应。优选地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述3-甲基喹啉-8-磺酰氯的丙酮溶液的浓度为1-10mg/mL。具体而言，由于血清中存在基质干扰，衍生化试剂3-甲基喹啉-8-磺酰氯的浓度低于1mg/mL会导致目标雌激素反应不完全，其浓度高于10mg/mL会造成衍生试剂不必要的浪费，且残留的试剂会对质谱仪器的离子源造成污染。详细地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述衍生化反应具体为，加入3-甲基喹啉-8-磺酰氯的丙酮溶液，随后通过加入碳酸盐缓冲溶液调节pH为8.5-11，混匀后置于恒温振荡器中，在30-70℃下避光震荡反应5-120min。具体地，经实验对比后发现，通过加入碳酸盐缓冲溶液调节pH为弱碱性，可有利于衍生化反应的进行。进一步地，在上述技术方案中，所述超高效液相色谱条件为：流动相A为0.1％(v/v)甲酸/水溶液；流动相B为0.1％(v/v)甲酸/甲醇溶液；流动相梯度洗脱参数为：其中，流动相A和流动相B的比例均为体积比。本专利技术在上述流动相梯度洗脱参数下，可以实现三种雌激素衍生物的最优分离，减少同分异构体共流出，降低基质干扰，提高雌激素定量分析的准确性和灵敏度。在本专利技术的超高效液相色谱-串联质谱技术中超高效液相色谱可以使用本领域中常用的色谱柱，为了提高分离效果和分离度，优选使用型号为Shim-packGISTC18(2μm，100*2.1mm)的色谱柱。再进一步地，在上述技术方案中，所述质谱条件具体为：电离源为电喷雾电离ESI源，其中雾化气流量为2.5-3.6L/min，干燥气流量为8-13.5L/min，加热气流量为9-15L/min，接口温度280-350℃，DL温度235-280℃，加热块温度380-450℃；质谱检测参数为：具体地，在上述技术方案中，所述质谱检测具体采用岛津8050三重四极杆质谱仪，模式为正离子模式，检测过程采用MRM的质谱扫描模式。又进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述液-液萃取采用乙酸乙酯。在本专利技术一个优选方案中，为了提高稳定性，准确度和灵敏度以及分离效率，所述液-液萃取具体包括：向待测血清样品与稳定同位素内标溶液的混合溶液中加入0.8-1.2mL乙酸乙酯，涡旋后在8000-12000r/min下离心2-4min，取上层清液，N2吹干。又进一步地，在上述技术方案中，步骤S3中，还包括，在检测前，将所述衍生化反应后的检测液置于3-5℃下冷却25-35s，随后离心取上清液进行检测。具体地，在本专利技术的一个优选实施方案中，所述流动相梯度洗脱参数为：其中，所述流动相的流速优选为0.4ml/min，色谱柱的柱温优选为40℃。在本专利技术中，可以使用本领域中常用的方法来得到各激素的具体浓度值。具体为：结合步骤S3得到的检测结果和各雌激素的标准工作曲线，得到各雌激素在血清中的含量值。详细地，在上述技术方案中，所述雌激素的标准工作曲线采用同位素内标定量法制得，具体步骤包括，分别取已知且不同浓度的雌酮、雌二醇和雌三醇的甲醇溶液，与内标溶液和空白血清基质混合，经过S1所述步骤得到不同浓度的标准待测液，使用化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱技术对所述不同浓度的标准待测液分别进行检测，以标准待测液中各雌激素与内标物峰面积比为Y轴，标准待测液中各类固醇激素浓度为X轴，得到各类固醇激素的标准工作曲线；所述化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱技术中的检测条件为步骤S3中的检测条件。其中，上述前处理步骤与在制备检测液的前处理步骤相同；上述超高效液相色谱-串联质谱技术中所有的参数与测定检测液的相应参数相同；上述标准待测液是将空白血清基质、混合内标溶液以及不同浓度含有3种激素的标准混合液混合制得。在本专利技术中，优选使用0.1％牛血清白蛋白溶液为空白血清基质。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术所提供的同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，通过采用3-甲基喹啉-8-磺酰氯对雌激素的酚羟基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，/n所述3种雌激素为雌酮、雌二醇和雌三醇；/n具体包括如下步骤：/nS1、将待测血清样品与稳定同位素内标溶液混匀后，通过液-液萃取提取目标激素；/nS2、采用3-甲基-8-喹啉磺酰氯进行衍生化反应；/nS3、采用超高效液相色谱-串联质谱技术对所述衍生化反应后的待测液进行检测。/n
【技术特征摘要】
1.同时检测血清中3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，
所述3种雌激素为雌酮、雌二醇和雌三醇；
具体包括如下步骤：
S1、将待测血清样品与稳定同位素内标溶液混匀后，通过液-液萃取提取目标激素；
S2、采用3-甲基-8-喹啉磺酰氯进行衍生化反应；
S3、采用超高效液相色谱-串联质谱技术对所述衍生化反应后的待测液进行检测。
2.根据权利要求1所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，
步骤S2中，通过加入3-甲基-8-喹啉磺酰氯的丙酮溶液进行衍生化反应；
优选地，步骤S2中，所述3-甲基-8-喹啉磺酰氯的丙酮溶液的浓度为1-10mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，
步骤S2中，所述衍生化反应具体为，加入3-甲基-8-喹啉磺酰氯的丙酮溶液，随后通过加入碳酸盐缓冲溶液调节pH为8.5-11，混匀后置于恒温振荡器中，在30-70℃下避光震荡反应5-120min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，
所述超高效液相色谱条件为：
流动相A为0.1％(v/v)甲酸/水溶液；
流动相B为0.1％(v/v)甲酸/甲醇溶液；
流动相梯度洗脱参数为：
5.根据权利要求1-3任一项所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，
所述质谱条件具体为：
电离源为电喷雾电离ESI源，其中雾化气流量为2.5-3.6L/min，干燥气流量为8-13.5L/min，加热气流量为9-15L/min，接口温度280-350℃，DL温度235-280℃，加热块温度380-450℃；
【专利技术属性】
技术研发人员：王献，范茹婷，肖华明，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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