【技术实现步骤摘要】
一种无转基因的基因编辑位点纯合体的筛选方法
本专利技术涉及基因编辑
，尤其涉及一种无转基因的基因编辑位点纯合体的筛选方法。
技术介绍
基因编辑技术包括ZFN、TANLEN、CRIPSR等技术。CRISPR技术因其方法简单、成本低等优点越来越成为主流技术，并被成功应用到动物、植物和微生物的不同种类的物种中。基因编辑技术不仅可以突破传统育种难以解决的遗传障碍，而且能实现特定性状的精准改变，颠覆已有动物遗传改良技术路径和选育效率。伴随着基因编辑技术的不断改进及其在动植物上的广泛应用，世界各地的研究人员已对不同物种的植物和动物的基因组进行了大量编辑，创制了新的变异，推动了动植物育种的进程。通过基因编辑获得T0转化个体后，需要进行一系列的检测来筛选不含转基因成分的突变个体。目前的基因编辑样品检测，主要通过PCR扩增检测载体带入的转基因片段，并通过PCR扩增和测序检测插入sgRNA序列和对应的靶标编辑位点序列。PCR扩增产物测序可以用一代测序或二代测序完成，该体系中PCR扩增和一代测序均无法实现高通量检测，样品量大时建库是...
【技术保护点】
1.一种无转基因的基因编辑位点纯合体的筛选方法，其特征在于，对目标基因发生基因编辑的T1代个体，利用针对转基因载体设计的KASP标记引物进行高通量筛选，去除含有转基因成分的个体，再对非转基因个体进行基因编辑靶标区段的扩增测序，筛选目标基因编辑位点纯合的个体。/n
【技术特征摘要】
1.一种无转基因的基因编辑位点纯合体的筛选方法，其特征在于，对目标基因发生基因编辑的T1代个体，利用针对转基因载体设计的KASP标记引物进行高通量筛选，去除含有转基因成分的个体，再对非转基因个体进行基因编辑靶标区段的扩增测序，筛选目标基因编辑位点纯合的个体。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以基因编辑后T0代个体的DNA为模板，分别针对基因编辑载体的sgRNA插入片段和目标基因编辑的靶标位点进行扩增测序，筛选去除多个载体插入或基因编辑载体插入后靶标位点未被编辑的个体；
(2)以T1代个体的DNA为模板，先针对转基因成分进行KASP高通量筛选，去除转基因个体，再对非转基因个体进行基因编辑靶标区段的扩增测序，筛选目标基因被编辑且编辑位点纯合的个体。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，若步骤(2)未筛选到编辑位点纯合的个体，则选取编辑位点杂合的个体繁育后代，对T2代个体进行基因编辑靶标区段的扩增测序，筛选目标基因被编辑且编辑位点纯合的个体。
4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，针对基因编辑过程中使用的载体序列的U6启动子和gRNAscaffold区段设计sgRNA标记引物。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述sgRNA标记引物序列如下：
sgPF：GAAGAGAAGCAGGCCCATTT；
sgPR：TGACCTGCAGGACTAGTGGA。
6.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述KASP高通量筛选是针对基因编辑过程中使用的基因编辑载体的U6启动子序列设计KASP标记引物。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述KASP标记引物序列如下：
KfPU6-1F：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAGAGAAGCAGGCCCATTT；
KfPU6-1R：GCGATGTGGGACTTTTGAAG。
8.一种非转基因烟草基因编辑纯合体后代的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(一)T0代基因编辑苗检测：
(1)隔离条件下用8×12的96孔育苗盘移栽种植T0代基因编辑苗；
(2)基因编辑苗移栽3周后，从幼嫩叶片上用剪刀剪取叶片，放入预先编号的96孔取样板的对应位置；
(3)叶片样品经冷冻干燥后研磨；
(4)提取叶片样品DNA，控制OD260/280比值介于1.7-2.0，浓度20ng/μL；
(5)根据载体的U6启动子和gRNAscaffold区段序列设计sgRNA标记引物，序列为：
sgPF：GAAGAGAAGCAGGCCCATTT；
sgPR：TGACCTGCAGGACTAGTGGA；
(6)PCR扩增sgRNA区段，
(7)对PCR扩增片段进行测序；
(8)根据测序结果筛选单一载体插入的植株样品；
(9)根据单一插入载体的sgRNA序列调取对应的靶标基因序列，设计P...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶昌荣，彭佩，李乐，唐顺学，肖金华，田冰川，
申请(专利权)人：华智生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。