半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，具体涉及半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法。该方法以BSM为基础培养基，甲醇为诱导剂，进行毕赤酵母工程菌的连续发酵及外源蛋白的连续表达，接种后菌体重复利用，连续性强，工艺流程较批次发酵有了简化，大大减少了工作强度及工作量，外源蛋白收率较批式发酵提升了40％，本发明专利技术流程简单，成本较低，适用于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法
本专利技术涉及生物工程领域，特别涉及半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法。
技术介绍
发酵工程，是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，一般分为批次发酵、补料批次发酵、连续发酵等。八十年代巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白(SCP)，有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX，其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。利用重组毕赤酵母进行发酵，生产外源蛋白，是一套非常完善的表达系统，已有上千种蛋白在该系统中成功表达，在制药领域已有胰岛素、白蛋白、乙肝抗原等多种蛋白使用毕赤酵母表达系统并实现商品化，因此高效的、工业化的发酵工艺研究一直是发酵人努力的方向。而毕赤酵母属于诱导型发酵，纵观行业现状，均以分批或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤1：制备种子液；/n步骤2：上罐发酵；将步骤1制得的所述种子液接种至发酵培养基，经第一轮发酵，流加含PTM1的甘油，调节流加速率使溶氧不低于20％，取样获得湿重；流加甲醇诱导外源蛋白表达，根据溶氧调节流加速率，保证溶氧不低于20％；/n步骤3：连续发酵；收集步骤2获得的部分发酵液，补加不含甘油的发酵培养基至诱导前的所述湿重，经第二轮发酵；/n步骤4：重复步骤3，直至外源蛋白表达量不达标。/n

【技术特征摘要】
1.半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：制备种子液；
步骤2：上罐发酵；将步骤1制得的所述种子液接种至发酵培养基，经第一轮发酵，流加含PTM1的甘油，调节流加速率使溶氧不低于20％，取样获得湿重；流加甲醇诱导外源蛋白表达，根据溶氧调节流加速率，保证溶氧不低于20％；
步骤3：连续发酵；收集步骤2获得的部分发酵液，补加不含甘油的发酵培养基至诱导前的所述湿重，经第二轮发酵；
步骤4：重复步骤3，直至外源蛋白表达量不达标。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述种子液的制备方法为：取毕赤酵母菌接种到种子液培养基，30℃、230rpm培养至OD:5.0～8.0；
所述种子液培养基(BMGY)包括：Yeastextract1％、Peptone2％、磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L、YNB1.34％、Biotin(4×10-5)％、Glycerol1％。


3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2中所述发酵培养基(BSM)包括：85％H3PO426.7ml/L、CaSO4·2H2O0.93g/L、K2SO418.2g/L、MgSO4·2H2O14.9g/L、KOH4.13g/L、甘油40g/L，100％氨水调pH5.0，灭菌后添加PMT14.0ml/L；
所述PMT1包括：CuSO4·5H2O6.0g/L、KI0.088g/L、MnSO4·H...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵枭阳，柴丹丹，李婷，李新乐，张晓雷，徐延伟，赵巧辉，李桂林，付光宇，吴学炜，杨增利，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41