本发明专利技术公开了一种抗牙鲆弹状病毒的单链抗体ScFv‑rHRV及其制备方法和应用，以及编码该单链抗体的基因、含有该基因的载体和宿主细胞等。该抗牙鲆弹状病毒的单链抗体，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过接头肽连接而成，并可通过原核表达系统进行高效表达。单链抗体ScFv‑rHRV的分子量约为28kD，能够特异识别牙鲆弹状病毒，可进一步用于该病毒的诊断、治疗制剂的开发和抗原表位研究。
【技术实现步骤摘要】
一种抗牙鲆弹状病毒的单链抗体
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种抗牙鲆弹状病毒的单链抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
牙鲆弹状病毒(Hiramerhabdovirus，HIRRV)为单股负链RNA病毒，是弹状病毒科粒外弹状病毒属新成员。HIRRV病毒粒子呈子弹状，长约160～180nm，宽约60～80nm，具有弹状病毒典型的形态学特征。1986年，HIRRV在日本兵库县的患病牙鲆和香鱼鱼苗中首次分离获得，随后陆续在中国、韩国等地发现了该病毒的存在。牙鲆弹状病毒主要感染牙鲆、香鱼，从幼鱼到成鱼均可被感染。感染鱼表现为鳍、肌肉组织及内部器官出血，造血器官坏死。人工感染试验发现，HIRRV对黑鲷、无备平鲉和虹鳟等海水鱼类或降河洄游鱼类也具有强烈致病性。目前，HIRRV已给全球海水养殖业造成了严重的经济损失。病毒的检测方法主要有细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断技术。单克隆抗体技术属于免疫学诊断技术，在病毒的检测方面得到了广泛应用。但单克隆抗体技术具有抗体基因容易丢失、抗体蛋白无法改造、工作量大等自身的一些缺陷。噬菌体抗体库逐渐成为一种重要的抗体制备技术，其原理是将抗体可变区基因与噬菌体衣壳蛋白基因连接，并表达在噬菌体表面，通过抗原对抗体库进行多轮亲和吸附，从中淘筛出所需的特异性抗体。PCR技术、噬菌体表面展示技术以及大肠杆菌重组表达技术促进了噬菌体抗体库技术的发展。通过PCR技术可以克隆出全套免疫球蛋白可变区基因，通过噬菌体表面展示技术可以将重组的免疫球蛋白可变区展示在噬菌体的表面，通过大肠杆菌重组表达技术可以将获得的特异性抗体进行重组、表达和大规模制备。因此，噬菌体抗体库技术可在较短的时间内开发出大量基因工程抗体，从而得到广泛应用。噬菌体抗体库技术开发的单链抗体ScFv仅仅是完整抗体的1/6，其分子量小可减少抗体的免疫原性，同时又是具有完全抗体结合位点的最小抗体片段。噬菌体抗体库技术的另一个优点是可以通过特异性抗体的基因序列，对蛋白质结构进行改造，从而设计出更优的改造抗体，通过基因工程技术可以对其进行大规模的生产。本专利技术采用噬菌体抗体库技术筛选了一种抗牙鲆弹状病毒的单链抗体，并进一步对其进行了抗体结构改造，为牙鲆弹状病毒诊断试剂开发、新型药物研究和抗原表位鉴定等提供了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗牙鲆弹状病毒的单链抗体，从而弥补现有技术的不足。通过构建噬菌体展示单链抗体库，“富集-洗脱-富集”的循环操作，从中筛选得到一种抗牙鲆弹状病毒的单链抗体ScFv-HRV，并经进一步改造获得优化的单链抗体ScFv-rHRV，构建了表达单链抗体的基因工程菌，从而为采用生物工程的方法大量制备该单链抗体提供了基础。本专利技术首先提供一种抗牙鲆弹状病毒的单链抗体ScFv-HRV，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1；编码上述蛋白的一种基因，其一种核苷酸序列为SEQIDNO:2；改造的单链抗体ScFv-rHRV的氨基酸序列为SEQIDNO:3；编码上述改造蛋白的一种基因，其一种核苷酸序列为SEQIDNO:4；本专利技术还提供一种抗牙鲆弹状病毒的单链抗体的制备方法，其制备步骤如下：1)将抗牙鲆弹状病毒的单链抗体基因插入表达载体中，构建成重组表达质粒；2)将构建的重组表达质粒转化宿主菌，构建重组基因工程菌，并进行单链抗体的重组表达；3)对重组表达的单链抗体进行纯化，并开发牙鲆弹状病毒的诊断、治疗制剂。本专利技术构建了表达抗牙鲆弹状病毒的单链抗体的重组菌株，经SDS-PAGE分析，表达出了28kD左右的重组目的蛋白。将重组蛋白纯化后可用于牙鲆弹状病毒的诊断、预防和治疗。具体实施方式下面结合具体实施方式来进一步描述本专利技术，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的技术方案的情况下可以对本专利技术的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本专利技术保护范围内。实施例1抗牙鲆弹状病毒的噬菌体单链抗体库的构建1、草鱼性腺细胞(GCO细胞)培养制备牙鲆弹状病毒，超速离心法进行病毒纯化后与弗氏完全佐剂1:1乳化，免疫BALB/c小鼠。14日后进行二免，免疫原为纯化的牙鲆弹状病毒与弗氏不完全佐剂1:1乳化制备。28日后进行三免。免疫原同二免。当小鼠的ELISA抗体效价达1:100000以上后，取小鼠脾脏，液氮研磨后加入Trizol试剂(每50-100mg脾脏加入1mlTrizol试剂)，室温静置5min，加入0.2ml氯仿，反复剧烈振荡15s，室温静置2-3min。4℃，12000g/min离心15min，吸取水相于另一干净1.5ml的离心管中，加入0.5ml异丙醇颠倒混匀，于-20℃沉淀30-60min，12000g/min离心10min。保留沉淀，70％的乙醇洗涤1遍，空气中晾干，DEPC处理水溶解沉淀RNA。2、基因组DNA的去除和反转录合成cDNA(采用天根公司的FastQuantcDNA第一条链合成试剂盒)：2.1基因组DNA的去除：按下述体系配制基因组DNA去除体系，彻底混匀。简短离心，并于42℃，孵育3min，然后放置于冰上。5×gDNABuffer2μlRNA模板1μgRNase-FreeddH2O补足到10μl2.2cDNA的合成：按下述体系配制混合液，充分混匀。将上述基因组DNA的去除体系和反转录体系混合，充分混匀，42℃孵育15min。95℃孵育3min后置于冰上，得到的cDNA可用于后继试验。3、设计和合成的小鼠抗体轻、重链可变区扩增引物：扩增单链抗体重链VH的引物：VH上：5-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTSMARCTGCAGSAGTC-3；VH下：5-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3。扩增单链抗体轻链VL的引物：VL上：5-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATYGAGCTCACYCAGTCTCC-3VL下：5-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTBAKYTCCARCTTKGTSCC-3。备注：B＝T、C、G；K＝T、G；M＝A、C；R＝A、G；S＝G、C；W＝A、T；Y＝C、T。用上述引物分别扩增上述cDNA模板，胶回收获得其轻、重链可变区基因片段。4、将上述扩增到的VH和VL基因片断分别用1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离、回收，然后将VH和VL等量混合作为模板进行重叠延伸PCR(SOE-PCR)以装配ScFv片断，条件为94℃1min变性、55℃1min退火、72℃1min延伸，共30个循环。PCR产物即为单链抗体基因片断，VH和VL基因之间是15个氨基酸的linker序列：GGGGSGGGGSGGGGS。5、将胶回收的ScFv基因和pCANTAB5E载体分别双本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗牙鲆弹状病毒的单链抗体，其特征在于，所述的单链抗体的氨基酸序列为SEQID NO:1。/n
【技术特征摘要】
1.一种抗牙鲆弹状病毒的单链抗体，其特征在于，所述的单链抗体的氨基酸序列为SEQIDNO:1。
2.一种核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段编码权利要求1所述的单链抗体。
3.如权利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列为SEQIDNO:2。
4.一种抗牙鲆弹状病毒的单链抗体，其特征在于，所述的单链抗体的氨基酸序列为SEQIDNO:3。
5.一种核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段编码权利要求4所述的单链...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯竹美，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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