用于表征蛋白质复合物的方法技术

本文提供了用于表征在蛋白质药物产物和可溶性配体之间形成的蛋白质复合物的方法。所公开的方法可以确定蛋白质复合物的大小、异质性和构象。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于表征蛋白质复合物的方法相关申请的交叉引用本申请要求2018年8月30日提交的美国临时专利申请号62/724,700的权益和优先权，该临时专利申请以引用的方式整体并入。
本专利技术整体涉及表征蛋白质复合物的系统和方法。
技术介绍
单克隆抗体(mAb)是一个正在发展的治疗领域，目前市场上有50多种单克隆抗体在售。多于一种单克隆抗体的组合疗法具有改善现有的单药疗法的功效的潜力。某些可溶性物质，尤其是具有若干重复表位的多聚体物质，可以两种或多种抗体结合，导致形成大型复合物。大型异质性抗体复合物的产生被称为“纸娃娃换装(paper-dolling)”。大型复合物可以被吞噬作用迅速消除，从而减少抗体的功效。大型蛋白质复合物也可以增加mAb的免疫原性。蛋白质复合物的大小范围从纳米到可见颗粒，使它们难以通过单一分析技术来表征。一种用于确定从约1nm至约1μ的颗粒大小的最普遍的技术之一是动态光散射法(DLS)。DLS是一种用于确定蛋白质大小分布谱的分析技术，适用于高通量应用(Zhou，M.，etal.，ChemMedChem，11：738-756(2016))。蛋白质在溶液中的布朗运动导致光发生散射，由此产生的散射强度随着颗粒大小而波动。因此，就多分散性而言，可以确定分布的平均半径和宽度。然而，DLS结果通常偏向较大的颗粒，并且颗粒必须相差至少三倍才能解决。因此，仅DLS不足以分析蛋白质复合物。由于蛋白质复合物的宽泛的大小范围，很多聚集体样品的高多分散性需要基于分离的方法来提供更详细的信息。分子排阻色谱法(SEC)是目前最常用的蛋白质分离色谱技术(Brusotti，etal.，Chromatographia，81：3-23(2018))。在SEC中，根据分子的流体动力学体积或大小进行分离。较小的分子的保留时间更长，因为它们能够扩散到固定相的孔中，而较大的分子则首先洗脱，因为它们被排除在孔外。然而，SEC受到分子量排阻限、样品至固定相的吸附、高压和高流速下的剪切降解以及无法根据组成来分离分析物的限制。当流场流动分馏法(FFF)被用于分离大型蛋白质和高摩尔质量聚合物时，它是有前景的SEC的替代方法。FFF样品分离使用流动辅助分离和分馏方法，其中分析物通过扩散系数的差异沿着带状通道分离(Fraunhofer，W.andWinter，G.，Eur.J.Pharm.Biopharm，58：369-383(2004))。FFF可以分离宽泛的大小范围(从纳米到微米)的分析物。FFF的开放通道可减少样品损失、降低压力和降低剪切速率。虽然FFF已经与其他分子技术(诸如检测蛋白质聚集体的光散射法)组合使用，但是仍然越来越需要对蛋白质复合物(包括mAb和可溶性配体复合物)的异质性和构象进行更充分地表征。因此，本专利技术的目的是提供用于鉴定具有形成大型蛋白质复合物能力的蛋白质药物产物的方法。本专利技术的另一个目的是提供鉴定和表征蛋白质药物产物和可溶性配体复合物的方法。
技术实现思路
提供了用于表征样品中的蛋白质复合物的方法。一个实施方案提供了一种用于通过以下步骤来评估样品中的蛋白质复合物的化学计量和大小分布的方法：通过不对称流场流分馏法(A4F)来分馏样品，以及使用多角度激光光散射法(MALLS)来确定样品中的蛋白质复合物的摩尔质量、化学计量和大小分布。在一些实施方案中，蛋白质复合物含有抗体或结合至抗体的配体的融合蛋白。配体通常是可溶性配体。配体可以是单体或多聚体。在一个实施方案中，配体可以是同源二聚体或异源二聚体。在另一个实施方案中，蛋白质复合物包含抗体∶配体复合物或融合蛋白∶配体复合物或者由抗体∶配体复合物或融合蛋白∶配体复合物组成。另一个实施方案提供了一种用于通过以下步骤来选择先导蛋白质药物产物的方法：将第一蛋白质药物产物添加至它的靶标或配体以产生蛋白质∶配体复合物，以及将第二蛋白质药物产物添加至第一蛋白质药物产物∶配体复合物以形成多种蛋白质∶配体复合物。所述方法包括分离蛋白质∶配体复合物，以及使用不对称流场流分馏法-MALLS法来确定蛋白质∶配体复合物的摩尔质量、化学计量和大小分布。所述方法还包括选择形成较少的大型蛋白质∶配体复合物的蛋白质药物产物作为先导靶标蛋白质药物。通常，蛋白质药物产物是抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白。在一些实施方案中，配体是可溶性配体。配体可以是单体或多聚体。在一些实施方案中，大型蛋白质复合物是异源性的。另一个实施方案提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有使用上文所述的方法来选择的先导蛋白质药物产物。在一些实施方案中，所公开的方法可以被用于确定靶向相同的配体的两种单独的抗体是否将形成大型异质性复合物。又一个实施方案提供了一种用于表征在蛋白质药物产物和可溶性配体之间形成的蛋白质复合物的方法，所述方法通过制备含有蛋白质药物产物及其配体的样品以产生蛋白质药物产物∶配体复合物来进行。所述方法包括分馏蛋白质药物∶配体复合物，以及通过多角度激光光散射法来分析所分馏的蛋白质药物∶配体复合物，以确定蛋白质复合物的摩尔质量和异质性。在一个实施方案中，通过不对称流场流分馏法来进行总蛋白的分馏。蛋白质的浓度通过UV/Vis来确定。可以通过比较由不同的蛋白质药物产物形成的蛋白质药物产物∶配体复合物的洗脱谱/时间来确定由不同的蛋白质药物产物与相同的配体形成的蛋白质复合物的构象差异。具有相同的摩尔质量的复合物的不同洗脱谱/时间表明，复合物可以具有不同的构象或形状。在一个实施方案中，分别分析每种蛋白质药物产物和相同的可溶性配体，以计算每种单独组分的摩尔质量，其中每种组分的摩尔质量被用于确定每种蛋白质复合物中的所述组分的估算化学计量。另一个实施方案提供了一种用于表征在蛋白质药物产物和可溶性配体之间形成的蛋白质复合物的方法，所述方法通过以下步骤来进行：使用不对称流场流分馏法来分馏蛋白质药物产物∶配体复合物，通过多角度激光光散射法来分析所分馏的蛋白质药物产物∶配体复合物，以表征蛋白质药物∶配体复合物的摩尔质量、化学计量或它们二者，以及通过将每种蛋白质复合物的大小与每种单独组分的估计大小进行比较来确定构成每种复合物的组分的异质性。附图说明图1A是一个抗体和一个配体之间形成的复合物的图示。图1B是一个抗体和两个配体之间形成的复合物的图示。图1C是四个抗体和五个配体之间形成的复合物的图示，它代表“纸娃娃换装”。图2A-2B是处于非线性构象的抗体1(黑色)、两个配体和抗体2(灰色)之间形成的复合物的图示。图2C-2D是处于线性构象的抗体1(黑色)、两个配体和抗体2(灰色)之间形成的复合物的图示。图3A是来自Ab1、蛋白质X以及摩尔比为5∶1、1∶1和1∶5的Ab1和蛋白质X的组合的SEC-MALLS分析的色谱图。X轴表示洗脱时间(分钟)。左Y轴表示摩尔质量(g/mol)，右Y轴表示在280nm处的吸光度(AU)。图3B是来自摩尔比为5∶1、1∶1和1∶5的Ab1和Ab2的组合的不对称流场流分馏法-MALLS法(A4F-MALLS)的分级本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于评估样品中的蛋白质复合物的化学计量和大小分布的方法，所述方法包括：/n通过不对称流场流分馏法(A4F)来分馏所述样品；以及/n使用多角度激光光散射法(MALLS)来确定所述样品中的所述蛋白质复合物的摩尔质量、化学计量和大小分布，其中异质性复合物由异质抗体:配体复合物或异质性融合蛋白:配体复合物组成。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180830 US 62/724,7001.一种用于评估样品中的蛋白质复合物的化学计量和大小分布的方法，所述方法包括：
通过不对称流场流分馏法(A4F)来分馏所述样品；以及
使用多角度激光光散射法(MALLS)来确定所述样品中的所述蛋白质复合物的摩尔质量、化学计量和大小分布，其中异质性复合物由异质抗体:配体复合物或异质性融合蛋白:配体复合物组成。


2.如权利要求1的所述方法，其中所述配体是可溶性配体。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段。


4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述抗体是双特异性抗体或其抗原结合片段。


5.一种用于选择先导蛋白质药物产物的方法，所述方法包括：
将第一蛋白质药物产物添加至包含所述第一蛋白质药物产物的靶标的第一样品中，以产生异质性蛋白质:配体复合物；
将第二蛋白质药物产物添加至含有相同的靶标的第二样品中，以形成蛋白质:配体复合物；
使用不对称流场流分馏法–多角度激光光散射法来分离所述异质性蛋白质:配体复合物，并且确定异质性蛋白质:配体复合物的所述大小分布和化学计量；以及
选择形成较少的蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·罗斯科尼，N·刘，E·派尔斯，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US