用于从头蛋白质测序的方法技术

本公开提供了一种确定多肽的氨基酸序列的方法，所述方法包括：使含有所述多肽的第一样品和第二样品分别与第一蛋白酶(例如，胰蛋白酶)和第二蛋白酶(例如，Tryp‑N)接触以产生第一组消化的肽片段和第二组消化的肽片段；对所述组消化的肽片段进行片段化以产生多组片段化的肽离子；从所述组肽离子中选择质量相差精氨酸氨基酸残基或赖氨酸氨基酸残基质量的肽离子对；为从所述两组片段化的肽离子选择的所述肽离子对分配离子类型(N末端肽离子或C末端肽离子)；在任一组片段化的肽离子中选择具有递增了一个或多个氨基酸残基的质量的递增质量的相同类型肽离子的质量梯，以及根据所述质量梯装配所述鉴定出的氨基酸残基以确定所述感兴趣的多肽的氨基酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于从头蛋白质测序的方法对序列表的引用本申请通过引用并入了以计算机可读形式提交的序列表，该计算机可读形式为文件10478WO01-Sequence.txt，该文件于2019年8月16日创建并且包含7,747字节。
本专利技术涉及生物药物，并且涉及蛋白质或多肽序列的从头测定。
技术介绍
传统上，蛋白质测序依赖于使用Edman降解化学方法对单个切割的N末端氨基酸进行序列检测，以及例如使用诸如差示HPLC保留和紫外吸收的技术对不同氨基酸Edman衍生物的检测和鉴定。最近，质谱法已被用于以增加的速度、准确性和灵敏度来对蛋白质或多肽进行测序和/或鉴定。然而，这些方法通常为低吞吐量的，并且仍然依赖于Edman降解。尽管在能够同时对大量不同的核酸分子进行测序的高通量大规模并行DNA测序平台方面已经取得了巨大的改进，但是质谱仪性能的进步却是递增的。在用于单独单个氨基酸残基水平的全局蛋白质测序的“下一代”平台的开发方面取得了相对较小的进展。因此，仍然需要用于对单个多肽进行测序的新颖方法和测定。
技术实现思路
在一个方面中，本专利技术提供了一种用于感兴趣的多肽的氨基酸序列的从头测定的方法，其中该方法包括：在允许切割碱性氨基酸后的肽键的第一蛋白酶消化所述感兴趣的多肽以产生第一组消化的肽片段的条件下，使含有所述感兴趣的多肽的第一样品与所述第一蛋白酶接触；对所述第一组消化的肽片段进行片段化以产生与所述第一组消化的肽片段中的肽相对应的第一组片段化的肽离子；确定所述第一组片段化的肽离子的质量；在允许切割碱性氨基酸之前的肽键的第二蛋白酶消化所述感兴趣的多肽以产生第二组消化的肽片段的条件下，使含有所述感兴趣的多肽的第二样品与所述第二蛋白酶接触；对所述第二组消化的肽片段进行片段化以产生与所述第二组消化的肽片段中的肽相对应的第二组片段化的肽离子；确定所述第二组片段化的肽离子的质量；从所述第一组片段化的肽离子和所述第二组片段化的肽离子中选择质量相差精氨酸氨基酸残基的质量或赖氨酸氨基酸残基的质量的肽离子对；为从所述两组片段化的肽离子中选择的所述肽离子对分配离子类型(N末端肽离子或C末端肽离子)；在任一组片段化的肽离子中选择具有递增了一个或多个氨基酸残基的质量的递增质量的相同类型肽离子的质量梯，并从所述肽离子质量梯装配鉴定出的氨基酸残基以确定所述感兴趣的多肽的氨基酸序列。在该方法的一些实施方案中，第一蛋白酶是胰蛋白酶。在该方法的一些实施方案中，第二蛋白酶是Tryp-N。在一些实施方案中，该方法还包括从第一组消化的肽片段中选择第一消化的肽片段；以及从第二组消化的肽片段中选择第二消化的肽片段，所述第二消化的肽片段具有与所述第一消化的肽片段相同的质量。在一些实施方案中，该方法还包括从第一组消化的肽片段中选择第一消化的肽片段；以及从第二组消化的肽片段中选择第二消化的肽片段，所述第二消化的肽片段的质量具有的与所述第一消化的肽片段的质量差等于赖氨酸氨基酸残基与精氨酸氨基酸残基之间的质量差。在该方法的各种实施方案中，分配片段化的肽离子对以得到氨基酸序列包括：从第一组消化的肽片段中选择第一消化的肽片段；对所述第一消化的肽片段进行片段化以产生与所述第一消化的肽片段对应的第一系列片段化的肽离子；从第二组消化的肽片段中选择与所述第一消化的肽片段相对应的第二消化的肽片段；对所述第二消化的肽片段进行片段化以产生与所述第二消化的肽片段相对应的第二系列片段化的肽离子；为从所述两组片段化的肽离子选择的肽离子对分配离子类型(N末端肽离子或C末端肽离子)；在任一组片段化的肽离子中选择具有递增了一个或多个氨基酸残基的质量的递增质量的相同类型肽离子的质量梯；以及从所选择的肽离子质量梯确定所述第一和第二消化的肽片段的单独氨基酸残基，以产生所述第一和/或第二片段化的肽的氨基酸序列。在各个实施方案中，从第一组片段化的肽离子和第二组片段化的肽离子中选择质量相差精氨酸氨基酸残基的质量的肽离子对。在各种实施方案中，来自第一组片段化的肽离子和第二组片段化的肽离子的肽离子对中的负精氨酸氨基酸残基质量差指示该肽具有N末端精氨酸残基。在各种实施方案中，来自第一组片段化的肽离子和第二组片段化的肽离子的肽离子对中的正精氨酸残基质量差指示该肽具有C末端精氨酸残基。在各种实施方案中，从第一组片段化的肽离子和第二组片段化的肽离子中选择质量相差赖氨酸氨基酸残基的质量的肽离子对。在实施方案中，来自第一组片段化的肽离子和第二组片段化的肽离子的肽离子对中的负赖氨酸氨基酸残基质量差指示该肽具有N末端赖氨酸残基。在实施方案中，来自第一组片段化的肽离子和第二组片段化的肽离子的肽离子对中的赖氨酸氨基酸残基的正质量差指示该肽具有C末端赖氨酸残基。在该方法的各种实施方案中，从第一组片段化的肽离子中选择的片段化的肽离子与从第二组片段化的肽离子中选择的片段化的肽离子相对应。在该方法的各种实施方案中，从第一组片段化的肽离子中选择的片段化的肽离子是b离子，并且从第二组片段化的肽离子中选择的片段化的肽离子为具有精氨酸氨基酸残基或赖氨酸氨基酸残基的质量差的b离子。在该方法的各种实施方案中，从第一组片段化的肽离子中选择的片段化的肽离子是y离子，并且从第二组片段化的肽离子选择的片段化的肽离子为具有精氨酸氨基酸残基或赖氨酸氨基酸残基的质量差的y离子。在该方法的各种实施方案中，使用质谱法测定质量。在该方法的各种实施方案中，使用串联质谱法产生片段离子。在该方法的各种实施方案中，感兴趣的多肽包括蛋白质。在该方法的各种实施方案中，感兴趣的多肽包括抗体，诸如单克隆抗体、单特异性抗体或双特异性抗体。附图说明图1A和图1B示出了使用Tryp-N蛋白酶消化的牛血清白蛋白(BSA)序列覆盖率。序列覆盖率为91.4％。由BSA的Tryp-N消化产生的各种肽片段示出在BSA蛋白序列(SEQIDNO:1)下方。图2A和图2B示出了使用胰蛋白酶蛋白酶消化的BSA序列覆盖率。序列覆盖率为94.2％。从BSA的胰蛋白酶消化产生的各种肽片段示出在BSA蛋白序列(SEQIDNO:1)下方图3示出了从模型多肽的Tryp-N蛋白酶和胰蛋白酶消化物产生的所得肽片段。考虑了四种不同的一级蛋白质序列模式。图4示出了对来自如在来自图3的情况(1)中所述生成的BSA的肽的分析。对于包含序列KLVNELTEFAK(SEQIDNO:2)的多肽，用胰蛋白酶消化产生肽LVNELTEFAK(SEQIDNO:3)。用Tryp-N消化产生肽KLVNELTEFA(SEQIDNO:4)。这两种肽具有相同的质量。然而，当在质谱分析期间被片段化时，从每个肽产生的b离子或从每个肽产生的y离子的质量相差单个赖氨酸氨基酸残基的质量。图5A至图5C示出了从图4中所示的对胰蛋白酶消化物和Tryp-N消化物的分析产生的质谱图，以及根据从质谱图生成的胰蛋白酶和Tryp-N离子图谱生成肽的一级序列。图5A是经受串联质谱的肽LVNELTEFAK(SEQIDNO:3)的示例性质谱，其示出了检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定感兴趣的多肽的氨基酸序列的方法，所述方法包括：/n在允许切割碱性氨基酸后的肽键的第一蛋白酶消化所述感兴趣的多肽以产生第一组消化的肽片段的条件下，使含有所述感兴趣的多肽的第一样品与所述第一蛋白酶接触；/n对所述第一组消化的肽片段进行片段化以产生与所述第一组消化的肽片段中的肽相对应的第一组片段化的肽离子；/n确定所述第一组片段化的肽离子的质量；/n在允许切割碱性氨基酸之前的肽键的第二蛋白酶消化所述感兴趣的多肽以产生第二组消化的肽片段的条件下，使含有所述感兴趣的多肽的第二样品与所述第二蛋白酶接触；/n对所述第二组消化的肽片段进行片段化以产生与所述第二组消化的肽片段中的肽相对应的第二组片段化的肽离子；/n确定所述第二组片段化的肽离子的质量；/n从所述第一组片段化的肽离子和所述第二组片段化的肽离子中选择质量相差精氨酸氨基酸残基的质量或赖氨酸氨基酸残基的质量的肽离子对；/n为所述肽离子对分配离子类型，以生成相同类型的肽离子的列表；/n选择具有递增了一个或多个氨基酸残基的质量的递增质量的肽离子质量梯以鉴定单独氨基酸残基，并装配鉴定出的氨基酸残基以确定所述感兴趣的多肽的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180817 US 62/719,2921.一种确定感兴趣的多肽的氨基酸序列的方法，所述方法包括：
在允许切割碱性氨基酸后的肽键的第一蛋白酶消化所述感兴趣的多肽以产生第一组消化的肽片段的条件下，使含有所述感兴趣的多肽的第一样品与所述第一蛋白酶接触；
对所述第一组消化的肽片段进行片段化以产生与所述第一组消化的肽片段中的肽相对应的第一组片段化的肽离子；
确定所述第一组片段化的肽离子的质量；
在允许切割碱性氨基酸之前的肽键的第二蛋白酶消化所述感兴趣的多肽以产生第二组消化的肽片段的条件下，使含有所述感兴趣的多肽的第二样品与所述第二蛋白酶接触；
对所述第二组消化的肽片段进行片段化以产生与所述第二组消化的肽片段中的肽相对应的第二组片段化的肽离子；
确定所述第二组片段化的肽离子的质量；
从所述第一组片段化的肽离子和所述第二组片段化的肽离子中选择质量相差精氨酸氨基酸残基的质量或赖氨酸氨基酸残基的质量的肽离子对；
为所述肽离子对分配离子类型，以生成相同类型的肽离子的列表；
选择具有递增了一个或多个氨基酸残基的质量的递增质量的肽离子质量梯以鉴定单独氨基酸残基，并装配鉴定出的氨基酸残基以确定所述感兴趣的多肽的氨基酸序列。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一蛋白酶是胰蛋白酶。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第二蛋白酶是Tryp-N蛋白酶。


4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述方法还包括：
从所述第一组消化的肽片段中选择第一消化的肽片段；以及从所述第二组消化的肽片段中选择第二消化的肽片段，所述第二消化的肽片段具有与所述第一消化的肽片段相同的质量。


5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法还包括：
从所述第一组消化的肽片段中选择第一消化的肽片段；以及
从所述第二组消化的肽片段中选择第二消化的肽片段，所述第二消化的肽片段的质量具有的与所述第一消化的肽片段的质量差等于赖氨酸氨基酸残基与精氨酸氨基酸残基之间的质量差。


6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中对来自所述第一组消化的肽片段的所述第一消化的肽片段进行片段化以产生与所述第一消化的肽片段对应的第一系列片段化的肽离子，并且对来自所述第二组消化的肽片段的与所述第一消化的肽片段对应的所述第二消化的肽片段进行片段化以产生与所述第二消化的肽片段对应的第二系列片段化的肽离子；并且其中分配所述肽离子对以得出氨基酸序列包括：
为所述肽离子对分配离子类型，以生成相同类型的肽离子的列表；
选择具有递增了一个或多个氨基酸残基的质量的递增质量的肽离子质量梯，以...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·毛，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US