一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用技术

本发明专利技术涉及分离纯化及检测技术领域，公开了一种支化聚乙烯亚胺‑恩诺沙星的合成方法及其应用，本发明专利技术利用支化聚乙烯亚胺分子上丰富的氨基量，通过EDC/NHS反应，将恩诺沙星连接到支化聚乙烯亚胺上，可根据不同偶联比该复合物分别应用于特异性抗体纯化以及作为包被抗原用于ELISA检测中。本发明专利技术方法的合成过程简单，可在较为粗糙的条件下进行，反应失败率几乎为零，所得复合物稳定性好。通过纯化抗体以及用于ELISA检测中，检测的灵敏度可提高10倍以上，有潜力作为新型材料克服免疫检测中的弊端，推广使用。

【技术实现步骤摘要】
一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用
本专利技术涉及分离纯化及检测
，尤其涉及一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用。
技术介绍
小分子危害物，例如农兽药残留等，是目前影响食品安全的重要因素，引起了广泛的关注和重视。欧盟和中国等很多国家，针对目前小分子药物的应用现状制订了更为严格的限量标准，甚至很多危害物质要求不能检出。因此，亟需建立快速、简单、高通量、低成本的筛查食品中农兽药残留等危害物质的检测技术。目前，ELISA免疫检测具有操作简单、灵敏度高、选择性强等特点，被广泛应用于农药和兽药残留的高通量分析和筛查。但是，ELISA检测中存在的多种问题，显著制约了其发展。尤其是多克隆抗体，在检测过程中，出现的假阳性，假阴性，高效价无竞争的情况，及检测灵敏度低等情况，是制约其发展的关键因素。而影响检测灵敏度的两大关键因素为抗体的质量以及ELISA的包被抗原有无非特异性结合。在多克隆抗体中，特异性抗体的比例仅在10%-20%之间，其余大量的非特异性抗体严重影响检测的灵敏度。而能否排除非特异性抗体的影响成为检测成功的关键。在目前的ELISA检测中，主流的包被抗原依然是采用BSA或者OVA作为载体，连接小分子物质，制备包被抗原，在偶联过程中，由于蛋白在DMF中易变性，偶联效率较低，最终产物得率较低，同时偶联比难以控制，且高纯度蛋白载体价格较为昂贵，其对于蛋白载体来讲，抗体对于载体蛋白的非特异性结合，是引起ELISA检测结果不稳定，灵敏度低，竞争有效价无有效竞争的关键原因。此外，在抗体纯化的过程中，由于特异性抗体属于痕量水平，很难从复杂的血清基质中获得，现有的大多数纯化抗体的方法只能区分抗体成分和非抗体成分，无法区分非特异性抗体和特异性抗体。因此，亟需开发一种新型的载体材料，具有性质稳定，价格低廉，容易合成加工，可以用于纯化抗体和免疫检测中，获得高质量抗体，同时提高检测灵敏度及准确率，对于小分子危害物的检测至关重要。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用，本专利技术方法的合成过程简单，可在较为粗糙的条件下进行，反应失败率几乎为零，所得复合物稳定性好；且偶联比可控，可通过调整小分子恩诺沙星的偶联比分情况用于特异性抗体纯化以及替代蛋白作为ELISA检测的包被抗原ELISA检测中。通过纯化抗体以及用于ELISA检测中，检测的灵敏度提高了10倍以上，有潜力作为新型材料克服免疫检测中的弊端，推广使用。本专利技术的具体技术方案为：第一方面，本专利技术提供了一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法，利用支化聚乙烯亚胺上丰富的氨基，通过EDC/NHS反应将恩诺沙星接枝到支化聚乙烯亚胺上，得到支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星。作为优选，所述合成方法包括以下步骤：1）恩诺沙星的活化：按摩尔比0.03:（0.09-0.1）:（0.09-0.1）将恩诺沙星、NHS和EDC溶解在NaOH水溶液和DMF的混合液中进行活化反应，得到活化的恩诺沙星。2）偶联：将活化的恩诺沙星加入到Mw=20000-30000的支化聚乙烯亚胺水溶液中，将所得混合溶液振荡处理以进行偶联反应。3）透析：将步骤2）所得偶联产物在水中透析处理以除去未反应的恩诺沙星，将所透析所得复合物进行冻干处理，得到支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星，即ENR-PEI。本专利技术合成方法的原理是利用支化聚乙烯亚胺分子上丰富的氨基量，通过EDC/NHS反应，将小分子恩诺沙星连接到支化聚乙烯亚胺分子上。支化聚乙烯亚胺是一种富含氨基的大分子材料，其来源广泛，价格便宜，易于购买，且易溶于水，化学性质稳定，且在有机溶剂合成的过程中，PEI能够保持性质的稳定，不易变性，其合成的ENR-PEI依然具有很稳定的性质，同时有助于增加不易溶于水药物的水溶性。本专利技术合成方法过程简单，可在较为粗糙的条件下进行，反应失败率几乎为零。此外，支化聚乙烯亚胺分子上丰富的氨基数目使得偶联反应很容易进行，且容易通过控制ENR的添加量控制偶联比，以分别满足特异性性抗体纯化和ELISA反应的需求。作为优选，步骤1）中：NaOH水溶液的浓度为0.01-0.05wt%，NaOH水溶液的和DMF体积比为1:（3-5）。作为优选，步骤1）中：恩诺沙星、NHS和EDC的总质量与混合液的固液比范围为5-10mg/mL。作为优选，步骤1）中：活化反应条件为：在15-25℃下，摇床80-110r/min振荡20-30h。作为优选，步骤2）中：所述聚乙烯亚胺水溶液的浓度为4-6mg/mL。作为优选，步骤2）中：偶联反应条件为1-6℃，反应时间10-15h。作为优选，步骤2）中：透析条件为：1-6℃，2-4天。第二方面，本专利技术提供了一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星（偶联比为45-55）在特异性抗体纯化中的用途：将支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星即ENR-PEI连接到溴化氢活化的琼脂糖凝胶上，制备抗体纯化柱，对多克隆抗体进行纯化，获得特异性抗体。在极高的偶联比情况下，ENR-PEI可作为纯化特异性抗体的配基，可有效提高痕量抗体的结合效率，去除非特异性抗体，获得高纯度的特异性抗体。（注：实时实例中纯化抗体的竞争IC50值可直接证明，非特异性抗体被去除，保留了高纯度特异性抗体。如本申请
技术介绍
部分所述，在现有技术的抗体纯化过程中，由于特异性抗体属于痕量水平，很难从复杂的血清基质中获得，现有的大多数纯化抗体的方法只能区分抗体成分和非抗体成分，无法区分非特异性抗体和特异性抗体。本专利技术ENR-PEI可有效分离特异性抗体和特异性抗体，其原因在于本专利技术采用抗原亲和纯化的原理，为获得高纯度的特异性抗体，高密度的抗原是必须的，因为复杂基质中的特异性抗体是极其痕量的，PEI上丰富的游离氨基为高密度抗原的偶联创造了条件。而当利用此复合物作为包被抗原时，相对于蛋白包被原来讲，蛋白的结构更为复杂，且蛋白之间存在的复杂相互作用导致的抗体和载体蛋白产生非特异性结合，引起假阳性的结果，严重影响免疫检测，而超支化聚乙烯亚胺是一种简单的线性结构，使得抗原容易暴露，且该材料没有免疫原性，抗体不会与载体产生非特异性结合，因此非特异性抗体不会影响检测（如图3）。作为优选，上述用途包括如下步骤：a）将溴化氢活化的琼脂糖凝胶在HCl溶液中分散活化，利用偶联缓冲液A将ENR-PEI与溴化氢活化的琼脂糖凝胶偶联，未结合的ENR-PEI通过偶联缓冲液A洗去，用Tris-HCl溶液封闭未反应的位点，洗掉Tris-HCl溶液并用PBS溶液洗涤，将所得产物制备为抗体纯化柱。b）血清采用偶联缓冲液B稀释，加到柱床，并用洗杂液A和洗杂液B洗涤杂蛋白，用Gly-HCl洗脱特异性抗体。作为优选，步骤a）中：所述溴化氢活化的琼脂糖凝胶与ENR-PEI的质量比为1:（0.020-0.025）。作为优选，步骤a）中：偶联反应条件为：室温，10-20r/min，4-8h。作为优选，步骤a）中：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法，其特征在于：利用支化聚乙烯亚胺上丰富的氨基，通过EDC/NHS反应将恩诺沙星接枝到支化聚乙烯亚胺上，得到支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星。/n

【技术特征摘要】
1.一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法，其特征在于：利用支化聚乙烯亚胺上丰富的氨基，通过EDC/NHS反应将恩诺沙星接枝到支化聚乙烯亚胺上，得到支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星。


2.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于包括以下步骤：
1）恩诺沙星的活化：按摩尔比0.03:（0.09-0.1）:（0.09-0.1）将恩诺沙星、NHS和EDC溶解在NaOH水溶液和DMF的混合液中进行活化反应，得到活化的恩诺沙星；
2）偶联：将活化的恩诺沙星加入到Mw=20000-30000的支化聚乙烯亚胺水溶液中，将所得混合溶液振荡处理以进行偶联反应；
3）透析：将步骤2）所得偶联产物在水中透析处理以除去未反应的恩诺沙星，将所透析所得复合物进行冻干处理，得到支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星，即ENR-PEI。


3.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，
步骤1）中：
NaOH水溶液的浓度为0.01-0.05wt%，NaOH水溶液的和DMF体积比为1:（3-5）；
恩诺沙星、NHS和EDC的总质量与混合液的固液比范围为5-10mg/mL；
活化反应条件为：在15-25℃下，摇床80-110r/min振荡20-30h；
步骤2）中：
所述聚乙烯亚胺水溶液的浓度为4-6mg/mL；
偶联反应条件为1-6℃，反应时间10-15h；
步骤3）中：透析条件为：1-6℃，2-4天。


4.一种以权利要求1-3之一所述合成方法所得的支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星在特异性抗体纯化中的用途，其特征在于，所述支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的偶联比为45-55。


5.如权利要求4所述的用途，其特征在于：将支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星即ENR-PEI连接到溴化氢活化的琼脂糖凝胶上，制备抗体纯化柱，对多克隆抗体进行纯化，获得特异性抗体。


6.如权利要求5所述的用途，其特征在于包括如下步骤：
a）将溴化氢活化的琼脂糖凝胶在HCl溶液中分散活化，利用偶联缓冲液A将ENR-PEI与溴化氢活化的琼脂糖凝胶偶联，未结合的ENR-PEI通过偶联缓冲液A洗去，用Tris-HCl溶液封闭未反应的位点，洗掉Tris-HCl溶液并用PBS溶液洗涤，将所得产物制备为抗体纯化柱；
b）血清采用偶联缓冲液B稀释，加到柱床，并用洗杂液A和洗杂液B洗涤杂蛋白，用Gly-HCl洗脱特异性抗体。


7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：
步骤a）中：
所述溴化氢活化的琼脂糖凝胶与ENR-PEI的质量比为1:（0.020-0.025）；
偶联反应条件为：室温，10-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：隋建新，韩香凝，王略丰，曹立民，林洪，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37