利用间充质干细胞分泌的活性因子制备疤痕凝胶的方法技术

本发明专利技术公开了利用间充质干细胞分泌的活性因子制备疤痕凝胶的方法，通过三维微载体接种脐带间充质干细胞，使用无血清培养基，利用生物反应器采用连续灌注的方式大规模生产细胞活性因子，并通过调整不同的温度将细胞活性因子与其它无生物毒性的成分共混制备疤痕凝胶，制备的疤痕凝胶，可以改变创伤微环境，调节多种细胞生理功能和代谢活动，促进多种细胞的增殖、迁移和分化，促进皮肤的修复与愈合至无疤痕。

【技术实现步骤摘要】
利用间充质干细胞分泌的活性因子制备疤痕凝胶的方法
本专利技术涉及利用间充质干细胞分泌的活性因子制备疤痕凝胶的方法，属于细胞工程领域。
技术介绍
皮肤作为人体最大的器官，起着保护体内组织的屏障作用，但是当皮肤受到的损伤达到一定的限度时，就容易留下难以修复的创面，比如烧伤、烫伤、手术切口、皮肤感染等创伤。疤痕不仅影响患者的形态美观，同时也会引起患者的功能活动障碍，甚至致畸，给患者的心理和生理上带来了严重的痛苦。随着生物技术的发展，生物材料广泛应用于医用敷料中，在医疗市场上获得了巨额的利润，如细胞生长因子、透明质酸、胶原蛋白、壳聚糖等。水凝胶敷料作为近年来新发展的一种新型敷料被进行重点研究，其具有三维结构，含有大量的亲水基团，为创伤提供湿润的环境，改善创面的微环境，加速创伤愈合，并减少疤痕形成；同时它可以形成防护层，阻止细菌等侵入创面。脐带间充质干细胞具有自我更新、多项分化和造血支持等功能，其来源广泛、获取方便、抗原性低。Burrington于1971年发现胎儿皮肤组织创伤修复后无瘢痕形成，首次提出无瘢痕愈合的概念，为临床创伤愈合质量、防治疤痕提供了新的思路和治疗策略，但是胚胎干细胞的获取与使用容易引发生物伦理学问题。而脐带来源的间充质干细胞是多功能干细胞，发育等级接近胚胎干细胞，在促进伤口愈合方面也优于成体干细胞。脐带间充质干细胞能治愈皮肤难以治愈的创伤，但是经注射或移植后的干细胞存活率低，且由于其无限增值能力导致其有潜在的致癌风险，使其应用具有很大的局限性。研究发现，间充质干细胞还可通过自分泌和旁分泌作用，释放多种细胞因子从而抑制创面炎症反应，促进各种结缔组织细胞的分裂、增殖、迁移至伤口处、合成分泌细胞外基质(胶原蛋白、透明质酸等)，达到创面修复的目的。同时，间充质干细胞还分泌胶原蛋白、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白等细胞外基质，能进一步为创面愈合提供适宜的微环境，促进细胞的增殖、迁移，加速创伤愈合。目前，临床上使用的细胞因子大多是由二维培养(比如贴壁生长)的细胞所分泌，细胞需要经过定期胰酶消化，操作过程复杂，比较费时。
技术实现思路
本专利技术克服了上述现有技术的不足，提供利用间充质干细胞分泌的活性因子制备疤痕凝胶的方法，通过三维微载体接种脐带间充质干细胞，使用无血清培养基，利用生物反应器采用连续灌注的方式大规模生产细胞活性因子，并通过调整不同的温度将细胞活性因子与其它无生物毒性的成分共混制备一种可以祛疤的疤痕凝胶。一种利用间充质干细胞分泌的活性因子制备疤痕凝胶的方法，包括如下步骤：1)取0.7-0.9重量份的卡波940、0.08-0.12重量份的卡波981、0.18-0.22重量份的PHA、0.008-0.012重量份的透明质酸和85-95重量份的去离子水依次加入乳化罐中，加热至70-100℃，保温搅拌15-40min至完全溶解，降温到40-50℃以下，获得A相溶液；2)取8-12重量份的丁二醇、1.6-2.0重量份的10％NaOH、0.3-0.7重量份的CHA150，依次加入步骤1)获得的A相溶液中，持续搅拌降温至室温，降温后加入0.1-0.5重量份的三维培养的脐带间充质干细胞分泌的活性因子，搅拌均匀获得疤痕凝胶，分装4℃保存。进一步的，上述步骤2)中所述的三维培养的脐带间充质干细胞分泌的活性因子的制备方法，包括如下步骤：S1选取脐带分离培养间充质干细胞，获得原代脐带间充质干细胞；S2将步骤S1中获得的原代脐带间充质干细胞扩增培养，细胞融合至80％左右获得传代脐带间充质干细胞；S3取无血清培养基置于二氧化碳培养箱中，35-36℃温育30min，获得处理后的培养基；S4取微载体Cytodex-3使用10-30mL步骤S3获得的处理后的培养基润洗，按1-10g/L的密度接种至搅拌式生物反应器中，加入1/3-1/2的工作体积的处理后的培养基，然后加入步骤S2中获得传代脐带间充质干细胞，细胞接种密度为105-106cells/mL，搅拌式生物反应器以30-50r/min搅拌6-24h，控制参数设为温度35-37℃，pH为6.8-7.4，溶解氧为30％-80％，补充培养基至前述工作体积后调节搅拌速度为40-70r/min；培养前期每3天更换50％培养基，6天后灌注培养，每天灌注，灌注体积为工作体积的0.5-2倍，提高搅拌速度到60-100r/min，温度35-37℃，pH为6.9-7.2，溶解氧为50-80％，收集细胞培养液；所述工作体积为生物反应器体积的55-70％；S5将步骤S4获得的细胞培养液2900-3000rpm离心8-10min，保留上清液，上清液使用0.22μm的无菌滤器过滤除菌后采用超滤浓缩法浓缩，超滤膜的截留分子量3000KD，获得脐带间充质干细胞分泌的活性因子，分装后置于-20℃长期冷冻保存。进一步的，上述步骤S1中所述的分离培养间充质干细胞，包括如下步骤：SS1选取新生儿脐带组织清洗后剥离脐带中的血管、表皮，获得华通胶；SS2将获得的华通胶切块后均匀铺在不加培养基的空白培养皿中，置于二氧化碳培养箱中，37℃、5％CO2，8-12h内加入完全培养基浸没组织块，5天半后换液，此后每2-3天换一次液，细胞融合达到80％-90％，获得原代脐带间充质干细胞。进一步的，上述步骤S2所述的原代脐带间充质干细胞扩增培养，包括如下步骤：将上述步骤S1中获得的原代脐带间充质干细胞用5ml生理盐水清洗2次，加入1ml胰酶-EDTA消化1-2min，加入7-10mL完全培养基终止消化，收集细胞，1000rpm离心5min，再用新鲜无血清培养基重悬细胞，计数，按1.5×107个细胞/mL接种至T150培养瓶，加入新鲜无血清培养基，在37℃、5％CO2条件下培养，细胞融合至80％左右，获得传代脐带间充质干细胞；进一步的，上述完全培养基的配方为450mLα-MEM培养基、50mL胎牛血清FBS、25μg人表皮生长因子、10μg血管内皮生长因子。进一步的，上述无血清培养基为475mLα-MEM培养基和25mLEliteGroTM-Adv混合。本申请还保护一种通过上述利用间充质干细胞分泌的活性因子制备疤痕凝胶的方法获得的疤痕凝胶。使用上述方法制备的疤痕凝胶在促进细胞的增殖、迁移和分化中的应用。有益效果：(1)本专利技术采用生物反应器结合微载体培养贴壁的间充质干细胞，使用连续灌注的方式，避免积累细胞代谢废物，达到细胞高密度和长时间生长的目的，使得干细胞分泌活性因子的产量得到了较高的提升，同时具有较高的生物学活性。(2)本专利技术采用无血清培养基培养脐带间充质干细胞，所得的干细胞分泌活性因子安全性高。(3)本专利技术采用三维培养技术使用无血清培养基培养脐带间充质干细胞，所得干细胞分泌活性因子的成分和含量与人体内几乎一致，同时还可获得胶原蛋白、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白等细胞外基质，基于此制备的疤痕凝胶，可以改变创伤微环境，调节多种细胞生理功能和代谢活动，促进多种细胞的增殖、迁移和分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用间充质干细胞分泌的活性因子制备疤痕凝胶的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)取0.7-0.9重量份的卡波940、0.08-0.12重量份的卡波981、0.18-0.22重量份的PHA、0.008-0.012重量份的透明质酸和85-95重量份的去离子水依次加入乳化罐中，加热至70-100℃，保温搅拌15-40min至完全溶解，降温到40-50℃以下，获得A相溶液；/n2)取8-12重量份的丁二醇、1.6-2.0重量份的10％NaOH、0.3-0.7重量份的CHA150，依次加入步骤1)获得的A相溶液中，持续搅拌降温至室温，降温后加入0.1-0.5重量份的三维培养的脐带间充质干细胞分泌的活性因子，搅拌均匀获得疤痕凝胶，分装4℃保存。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用间充质干细胞分泌的活性因子制备疤痕凝胶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取0.7-0.9重量份的卡波940、0.08-0.12重量份的卡波981、0.18-0.22重量份的PHA、0.008-0.012重量份的透明质酸和85-95重量份的去离子水依次加入乳化罐中，加热至70-100℃，保温搅拌15-40min至完全溶解，降温到40-50℃以下，获得A相溶液；
2)取8-12重量份的丁二醇、1.6-2.0重量份的10％NaOH、0.3-0.7重量份的CHA150，依次加入步骤1)获得的A相溶液中，持续搅拌降温至室温，降温后加入0.1-0.5重量份的三维培养的脐带间充质干细胞分泌的活性因子，搅拌均匀获得疤痕凝胶，分装4℃保存。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的三维培养的脐带间充质干细胞分泌的活性因子的制备方法包括如下步骤：
S1选取脐带分离培养间充质干细胞，获得原代脐带间充质干细胞；
S2将步骤S1中获得的原代脐带间充质干细胞扩增培养，细胞融合至80％左右获得传代脐带间充质干细胞；
S3取无血清培养基置于二氧化碳培养箱中，35-36℃温育30min，获得处理后的培养基；
S4取微载体Cytodex-3使用10-30mL步骤S3获得的处理后的培养基润洗，按1-10g/L的密度接种至搅拌式生物反应器中，加入1/3-1/2的工作体积的处理后的培养基，然后加入步骤S2中获得传代脐带间充质干细胞，细胞接种密度为105-106cells/mL，搅拌式生物反应器以30-50r/min搅拌6-24h，控制参数设为温度35-37℃，pH为6.8-7.4，溶解氧为30％-80％，补充培养基至前述工作体积后调节搅拌速度为40-70r/min；培养前期每3天更换50％培养基，6天后灌注培养，每天灌注，灌注体积为工作体积的0.5-2倍，提高搅拌速度到60-100r/min，温度35-37℃，pH为6.9-7.2，溶解氧为50-80％，收集细胞培养液；所述工...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙红，邢志青，崔晨聪，王杰，张甜甜，张平，郑海阳，
申请(专利权)人：济南磐升生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37