基于效率的qPCR初始浓度检测的高鲁棒性六参数全局拟合法制造技术

本发明专利技术涉及一种基于效率的qPCR初始浓度检测的高鲁棒性六参数全局拟合法。本发明专利技术通过化学反应的原理与推导，给出了荧光值和效率值变化规律的六参数数学模型。以均方差函数作为误差函数，对实验数据值进行全局拟合的最优化求解。通过对效率值进行线性放缩，消除机器检测线的设定和检测灵敏度的影响，提高算法的鲁棒性与通用性。通过修正的荧光值和效率值进行反推，获取准确的初始荧光值，并利用已知的荧光值和浓度关系曲线或数据对，通过比对或等比计算求得初始浓度值。

【技术实现步骤摘要】
基于效率的qPCR初始浓度检测的高鲁棒性六参数全局拟合法
本专利技术涉及实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)领域，具体涉及一种利用实时荧光定量聚合酶链式反应对核酸样本初始浓度进行绝对或相对定量的方法。
技术介绍
实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)是一种通过聚合酶链式反应扩增核酸样本，并通过荧光实时反映核酸分子数量的技术。qPCR技术被广泛应用于核酸样本的定量，是核酸定量分析中最重要的工具。目前利用实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)进行核酸定量的主流方法是循环阈值法(Ct法)。该方法为核酸样本经qPCR扩增得到的扩增曲线(纵坐标为荧光量，横坐标为循环数)设定一个统一的荧光阈值，依据该荧光阈值求出各扩增曲线所对应的分数循环阈值(Ct)。由聚合酶链式反应的指数扩增机理，Ct值与样本初始浓度的对数呈线性关系，从而可以通过已知浓度样本的一系列稀释实验建立起Ct值与初始浓度的关系曲线，即标准曲线。这样，只要有未知浓度的样本的Ct值，即可在标准曲线上找到对应的初始浓度。该方法的不足是实际实验不完全符合聚合酶链式反应理论上的指数扩增机理；未知样本的扩增效率与已知样本的扩增效率不同，导致得到的样本初始浓度不准确；需要建立标准曲线，较为繁琐；只利用了指数扩增区的数据，忽视了指数区以外的数据中所蕴含的信息。另一个重要的方法是S形曲线拟合法(SCF)。该方法认为聚合酶链式反应的扩增曲线符合逻辑斯蒂增长规律，对核酸样本的qPCR扩增曲线进行S形曲线(逻辑斯蒂曲线)拟合。拟合后可以直接得到核酸样本的初始浓度(以荧光量为单位)，也有进一步求取Cy0，建立Cy0与样本浓度的标准曲线来求得样本浓度。该方法的不足是qPCR反应的逻辑斯蒂扩增机理缺少理论支持，拟合后直接求得的样本浓度不准确，对扩增曲线的后半部分拟合效果不好。AnaC.Carr,SeanD.Moore于2012年在《RobustQuantificationofPolymeraseChainReactionsUsingGlobalFitting》一文中提到了一种对qPCR扩增曲线进行全局拟合，进而求取核酸样本初始浓度的方法。该方法的拟合公式有较好的理论支持。其不足是鲁棒性不足，若将机器检出限以下的荧光数据纳入拟合，求得的样本浓度不准确。
技术实现思路
本专利技术的目的是：基于化学机理，利用效率放缩的方法，提出一种qPCR初始浓度检测的方法。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案是提供了一种基于效率的qPCR初始浓度检测的高鲁棒性六参数全局拟合法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、建立六参数全局拟合的递推公式如下式(1)所示：式(1)中，Fn表示第n次循环所获得的荧光值，a、b、c、d均为模型参数；步骤2、设定背景荧光值为参数bg，设置最初荧光值为参数F0，将包括参数bg、参数F0、参数a、b、c、d在内的总计六个参数代入式(1)所示的递推公式，获取六参数的拟合结果序列；步骤3、将拟合结果序列和机器获取的所有实验值进行比较，利用优化算法对式(1)所示的递推公式进行优化，最终获取参数bg、参数F0、参数a、b、c、d的最优参数值；步骤4、获取拟合后的效率变化趋势利用基于化学原理的效率拟合公式，如下式(2)所示，代入步骤3获取的六个最优参数值，计算得到拟合后的每个扩增循环的效率值，获取效率变化趋势：式(3)中，En表示第n次循环所获得的效率值；步骤5、根据机理分析，将获取的效率值进行线性放缩，使得效率范围放缩到相应区间；步骤6、反推得到精确的初始荧光值将拟合得到的末态循环的荧光值，利用放缩后的每个循环的效率值，进行逐步反推计算，得到最初的检测荧光值；步骤7、对应获取最初浓度值。优选地，利用优化算法对式(1)所示的递推公式进行优化时，设置均方差函数作为误差函数对问题进行最优化，最终获得全局拟合的参数bg、参数F0、参数a、b、c、d的最优参数值。优选地，步骤5中，效率值进行线性放缩时，使得效率最小值保持不变，效率最大值放缩到2。优选地，步骤5中，设放缩后的第n次循环的效率值为则有：式(4)中，Emin为步骤4获得的效率最小值，Emax为步骤4获得的效率最大值。优选地，步骤7中，根据已知的荧光值大小和初始浓度的对应关系曲线，或者已知的一对荧光值和初始浓度的数据对，通过对照曲线或者等比计算，得到本次实验的初始检测荧光值对应的初始浓度。本专利技术通过化学反应的原理与推导，给出了荧光值和效率值变化规律的六参数数学模型。以均方差函数作为误差函数，对实验数据值进行全局拟合的最优化求解。通过对效率值进行线性放缩，消除机器检测线的设定和检测灵敏度的影响，提高算法的鲁棒性与通用性。通过修正的荧光值和效率值进行反推，获取准确的初始荧光值，并利用已知的荧光值和浓度关系曲线或数据对，通过比对或等比计算求得初始浓度值。与现有技术相比，本专利技术基于化学机理，利用效率放缩的方法，提出了一种六参数全局拟合的实时荧光定量聚合酶链式反应qPCR初始浓度检测的方法。通过化学原理的理解与推导，提出了荧光值和效率值在扩增过程中变化的六参数数学模型，该模型较之传统Ct法的指数模型和SCF的S型模型更符合生物扩增的真实过程。使用最小化误差函数进行优化，获取实验数据全局拟合的拟合数据。该拟合过程无需满足Global-Fitting等方法中机器检测线之上的数据才能进行拟合的要求，算法实施更简便、快捷。由于机器检测线的设定以及检测线下精度和检测灵敏度的影响，导致拟合荧光值和效率值的绝对大小有所偏差，但变化规律符合机理。因此对效率值进行线性放缩，将变化规律映射到绝对数值上。经过修正的荧光值和效率值具有高鲁棒性，对机器检测线的设定以及检测线下精度和检测灵敏度的要求不高，且对不同试剂均适用，通用性较好。最终，利用修正的荧光值和效率值进行反推，获取准确的初始荧光值，与已有曲线或者数据对进行比对，获取初始浓度值。附图说明图1为本专利技术提供的算法拟合效果图示例；图2为本专利技术提供的算法实施流程图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本实施例以一次40个循环的实验数据为例，给出具体的计算公式和详细的计算过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实例。已有机器检测的一次实验40个循环的荧光值序列数据：xi,i＝1,2,……,40根据化学原理，推导得到如下式(1)所示的六参数全局拟合的递推公式：式(1)中，Fn表示第n次循环所获得的荧光值，a、b、c、d均为模型参数。步骤S101，计算拟合值的过程中，设定背景荧光值为参数bg，设置最初荧光值为参数F0，将包括参数bg、参数F0、参数a、b、c、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于效率的qPCR初始浓度检测的高鲁棒性六参数全局拟合法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1、建立六参数全局拟合的递推公式如下式(1)所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种基于效率的qPCR初始浓度检测的高鲁棒性六参数全局拟合法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、建立六参数全局拟合的递推公式如下式(1)所示：



式(1)中，Fn表示第n次循环所获得的荧光值，a、b、c、d均为模型参数；
步骤2、设定背景荧光值为参数bg，设置最初荧光值为参数F0，将包括参数bg、参数F0、参数a、b、c、d在内的总计六个参数代入式(1)所示的递推公式，获取六参数的拟合结果序列；
步骤3、将拟合结果序列和机器获取的所有实验值进行比较，利用优化算法对式(1)所示的递推公式进行优化，最终获取参数bg、参数F0、参数a、b、c、d的最优参数值；
步骤4、获取拟合后的效率变化趋势
利用基于化学原理的效率拟合公式，如下式(2)所示，代入步骤3获取的六个最优参数值，计算得到拟合后的每个扩增循环的效率值，获取效率变化趋势：



式(3)中，En表示第n次循环所获得的效率值；
步骤5、根据机理分析，将获取的效率值进行线性放缩，使得效率范围放缩到相应区间；
步骤6、反推得到精确的初始荧光值
将拟合得到的末态循环的荧光值，利用放缩后的每个循环的效率值，进行逐步反推计算，得到最...

【专利技术属性】
技术研发人员：何屹东，姚思越，袁旭军，王振煜，陈悦民，郭彩虹，周志鹏，贡亮，张菊梅，陈鲁，张健伟，
申请(专利权)人：上海科源电子科技有限公司，广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，广东环凯生物科技有限公司，上海纽钛测控技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31