一种UPLC-MS/MS检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷的方法技术

本发明专利技术公开了一种UPLC‑MS/MS检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷的方法，包括以下步骤：(1)将龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷分别配置浓度为0.25‑0.5mg/mL的标准品溶液，备用；(2)配制新疆假龙胆的样品溶液，然后对样品溶液进行前处理，再利用UPLC‑MS/MS法检测新疆假龙胆中的环烯醚萜苷。本发明专利技术中选用UPLC‑MS/MS技术作为活性组分检测分析方法，检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷，具有快速灵敏、稳定易重现的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种UPLC-MS/MS检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷的方法
本专利技术涉及检测分析
，更具体的说是涉及一种UPLC-MS/MS检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷的方法。
技术介绍
新疆假龙胆(Gentianellaturkestanerum(Gand.)Holub)是龙胆科(Gentiananceae)假龙胆属(Gentianella)植物，是新疆的优势药用资源之一。新疆假龙胆是维医、蒙医和藏医习用药材，具有清热解毒、利湿消肿等功效。在化学成分方面，已有学者对假龙胆属植物做了化学研究，分离得到主要化合物为环烯醚萜苷类，是具有环戊二烯并吡喃环基本骨架的单萜类化合物，其他成分还有二倍半萜类、三萜类等。专利技术人前期对不同海拔高度的10批新疆假龙胆中5种活性成分进行含量测定，结果显示，各个批次药材中含量最高的是獐牙菜苦苷，其次分别为龙胆苦苷、獐牙菜苷，以上均为环烯醚萜苷类成分。龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷等环烯醚萜苷类成分不仅是假龙胆属植物的主要功效成分，还是其特征性成分，具有保肝利胆、神经保护、抗氧化、增强免疫等药理活性，应用前景广泛。药代动力学常用检测方法有HPLC(高效液相色谱)、GC(气相色谱)、LC–MS(液相色谱-质谱联用)、UPLC-MS/MS(超高效液相色谱-质谱联用)、GC-MS(气相色谱-质谱联用)等，HPLC法因操作简便而被常用于药代动力学方法学的建立，但随着代谢组学和系统生物学在中药活性组分分析研究中的快速发展，HPLC法分析效率低、检测速度慢，容易受到采样环境中杂质、干扰物的影响，使其分析灵敏度和特异性较差，极大程度限制了其应用，后续延伸出的UPLC技术虽在检测模块上有很大进步，但仍未突破传统HPLC分离强、鉴别定量弱的技术瓶颈。UPLC-MS/MS技术将色谱技术的高分离能力与质谱技术的高灵敏和结构解析能力成功结合，成为应用广泛、潜能巨大的分离分析技术。UPLC-MS/MS技术具有较好的灵敏性、重现性对于生物样本不需要衍生化处理而成为代谢组学最常用、最适宜的研究工具。目前，对于假龙胆属植物的研究较少，对新疆假龙胆更鲜有报道。已有的报道仅限于新疆假龙胆化学成分的含量测定以及少许药理学研究，但是，尚未见有应用UPLC-MS/MS技术考察新疆假龙胆环烯醚萜苷药代动力学特征的研究报道。因此，如何提供一种效率高、准确度高、灵敏度高的UPLC-MS/MS检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种能够准确且高效的检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种UPLC-MS/MS检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷的方法，包括以下步骤：(1)将龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷分别配置浓度为0.25-0.5mg/mL的标准品溶液，备用；(2)配制新疆假龙胆的样品溶液，并对样品溶液进行前处理，再利用UPLC-MS/MS法检测新疆假龙胆中的环烯醚萜苷。本专利技术的有益效果：本专利技术中选用UPLC-MS/MS技术作为活性组分检测分析方法，检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷，具有快速灵敏、稳定易重现的效果。优选地，步骤(2)中，所述前处理的具体操作为：(21)将样品溶液进行涡旋处理后加入乙腈，离心后吸取上清液，氮吹吹干，得到固体样品；(22)在固体样品中加入有机溶液复溶，再进行涡旋处理，离心后吸取上清液后过滤膜，得到前处理后的样品溶液。优选地，步骤(21)中，所述涡旋处理时间为1-3min；所述乙腈的添加量为100-300μL，所述乙腈与样品溶液的体积比为(1-3)：1；所述氮吹处理中，针头距离液面的高度为2-3cm。更加优选地，所述涡旋处理时间为1min；所述乙腈的添加量为300μL。优选地，步骤(22)中，所述有机溶液的添加量为50-100μL，所述有机溶液与固体样品的质量比为(1-3)：1，所述有机溶液为水与甲醇的混合溶液；其中，所述甲醇与水的体积比为1:(1-2)；所述滤膜的直径为0.22-0.30μm。更加优选地，所述有机溶液的添加量为100μL，所述甲醇与水的体积比为1:1；所述滤膜的直径为0.22μm。。优选地，步骤(21)和(22)中，所述离心的条件均为：离心速度为8000-12000r/min，时间为8-10min。更加优选地，离心速度为12000r/min，时间为10min。采用上述方案的有益效果：本专利技术分别考察了甲醇和乙腈蛋白沉淀法、乙酸乙酯液液萃取法和SPE固相萃取法。结果发现采用乙酸乙酯液液萃取法提取三种化合物，提取回收率较低，且存在严重的基质效应回收率仅为30％左右。SPE固相萃取法实验结果表明该方法回收率几乎为零，不适用于苷类化合物。在比较蛋白沉淀法时，选用甲醇和乙腈两种蛋白沉淀剂，乙腈沉淀效果较甲醇相比，效果更好、杂质少且回收率高。因此，本专利技术最终采用乙腈蛋白沉淀萃取法进行样品的前处理。采用氮气处理，若氮气流速过大，可能造成样品被吹出离心管，样品浓度降低，本专利技术研究得到氮气经针阀管和针头吹向液体样品试管，可通过调整锁紧螺母可以上下滑动针阀管，调整针头高度，距离液面约2-3cm为最佳距离，以样品表面吹起波纹，样品又不溅起为好。优选地，步骤(2)中，所述UPLC-MS/MS法检测的具体操作：(23)将前处理后的样品溶液采用液相色谱进样口进样；(24)进样后，采用正离子方式进行质谱检测；其中，离子源为电喷雾离子源；扫描方式为选择反应监测；毛细管电压：3500V；锥孔电压：45V；提取锥孔电压：3V；RF透镜电压：0.1V；离子源温度：120℃；脱溶剂温度：350℃；碰撞气流：0.20mL/min。优选地，步骤(23)中，所述液相色谱条件为：色谱柱为XBridgeTMBEHC182.5μm；流动相：甲醇(B)-水(A)；流速：0.4mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；梯度洗脱。其中，V甲醇：V水＝(3-7):7。优选地，所述梯度洗脱程序为：0-2min：70％A、30％B；2-4min：30％A、70％B；4-5min：70％A，30％B。采用上述技术方案的有益效果：本专利技术中采用液相色谱和质谱联用，且，在上述色谱及质谱条件下能够达到高效、快速、稳定、分离好、重现性好的效果。本专利技术中还公开了UPLC-MS/MS检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷的方法在血浆中的应用。液质联用技术因其仪器特殊性，使得其样品前处理方法复杂、成分昂贵、操作要求高，本专利技术针对这一弊端多次尝试，血浆样品水溶性干扰成份多，而环烯醚萜苷类化合物属于水溶性较强的物质，易与血浆中亲水性干扰融合，难以分离，因此合适的样品前处理过程及有效的检测手段是完成环烯醚萜苷类生物样本分析的重要保证。而本专利技术中的方案克服了上述缺陷。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种UPLC-MS/MS检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷分别配置浓度为0.25-0.5mg/mL的标准品溶液，备用；/n(2)配制新疆假龙胆的样品溶液，并对样品溶液进行前处理，再利用UPLC-MS/MS法检测新疆假龙胆中的环烯醚萜苷。/n

【技术特征摘要】
1.一种UPLC-MS/MS检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷分别配置浓度为0.25-0.5mg/mL的标准品溶液，备用；
(2)配制新疆假龙胆的样品溶液，并对样品溶液进行前处理，再利用UPLC-MS/MS法检测新疆假龙胆中的环烯醚萜苷。


2.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述前处理的具体操作为：
(21)将样品溶液进行涡旋处理后加入乙腈，离心后吸取上清液，氮吹吹干，得到固体样品；
(22)在固体样品中加入有机溶液复溶，再进行涡旋处理，离心后吸取上清液后通过滤膜，得到前处理后的样品溶液。


3.根据权利要求2所述的一种UPLC-MS/MS检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷的方法，其特征在于，步骤(21)中，所述涡旋处理时间为1-3min；
所述乙腈的添加量为100-300μL，所述乙腈与样品溶液的体积比为(1-3)：1；
所述氮吹处理中，针头距离液面的高度为2-3cm。


4.根据权利要求2所述的一种UPLC-MS/MS检测新疆假龙胆中环烯醚萜苷的方法，其特征在于，步骤(22)中，所述有机溶液的添加量为50-100μL，所述有机溶液与固体样品的质量比为(1-3)：1；
其中，所述有机溶液为水与甲醇的混合溶液，所述甲醇与水的体积比为1:(1-2)；
所述滤膜的直径为0.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨建华，胡君萍，居博伟，
申请(专利权)人：新疆医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：新疆;65