一种用于百合miRNA检测的内参基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于百合miRNA检测的内参基因及其应用。本发明专利技术提供一种用于百合miRNA检测的内参基因，其具有如SEQ ID NO.1‑4任一所示的核苷酸序列。本发明专利技术提供的内参基因miRn46和miR399a在百合不同生长发育阶段、组织部位、非生物胁迫和生物胁迫条件下均能够稳定表达，适于作为不同实验条件下的百合miRNA相对水平检测的内参基因。与传统的内参基因相比，miRn46和miR399a作为内参基因具有更高的稳定性，能够显著提高百合miRNA相对水平检测的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种用于百合miRNA检测的内参基因及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种用于百合miRNA检测的内参基因及其应用。
技术介绍
百合是一种兼具食用、药用及观赏价值的重要的球根花卉，具有十分重要的经济价值。为了改良百合植株性状，需要利用现代分子生物学手段对其重要的生理过程，包括开花，抗病和无性繁殖的调控机制等进行研究，这其中必然会涉及对百合基因表达丰度的检测。随着植物生物遗传研究的精细化，关于miRNA在百合各种生理过程中的功能研究也越来越多。miRNA(microRNA)是一类长度约为21nt的内源非编码RNA，已被证实在植物生理过程中发挥着重要的调控作用。qRT-PCR(quantitativereal-timepolymerasechainreaction)是研究基因表达模式，比较基因表达丰度的最常用的生物手段之一，具有灵敏度高、易操作、特异性好、信息丰富的特点。而在众多影响该实验结果准确度的因素中，用来标准化实验结果的内参基因的选择是保证实验结果准确的前提和关键。作为内部控制，理想的内参基因应在实验条件下保证较高的、稳定的表达量，即易于检测且表达恒定。但在不同条件下中，表达绝对稳定不变的内参基因是不存在的。同时由于miRNA的qRT-PCR扩增产物较短且部分miRNA在不同条件下表达量差异较大，较mRNA的qRT-PCR，miRNA检测难度更大。因此，在miRNA的qRT-PCR实验中，选择稳定的内参基因，对结果的准确度保证更为重要。目前，在植物中，使用较多的传统的内参基因包括snRNAU6、rRNA5S、5.8S、18S和GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)等，这些基因广泛参与基本的细胞过程，并在所有细胞中比较均匀地表达。但这些传统内参基因在一些实验条件下，表达量并不恒定不变(ThellinO,ZorziW,LakayeB,BormanBD,CoumansB,HennenG,GrisarT,IgoutA,HeinenE.Housekeepinggenesasinternalstandards:useandlimits.JBiotechnol.1999；75(2):291-295；JainMK,NijhawanA,TyagiAK,KhuranaJP.Validationofhousekeepinggenesasinternalcontrolforstudyinggeneexpressioninricebyquantitativereal-timePCR.BiochemBiophResCo.2006；345(2):646-651.)。此外，百合基因组巨大，生理调控过程复杂，但目前尚未见在百合中系统评价适用于miRNAqRT-PCR的候选内参基因在不同实验条件下稳定性的报道。因此，在以miRNA为检测对象的qRT-PCR检测之前，为保证检测结果的准确性，筛选出适合于尽可能多的实验条件，特别是涉及不同生长发育的样本的内参基因，是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于百合miRNA检测的内参基因，本专利技术还提供该内参基因的应用。为获得在不同条件下稳定表达的用于百合miRNA检测的内参基因，本专利技术首先构建了百合smallRNA文库，在该SmallRNA文库中，首先，采用归一化方法确定miRNA的表达谱，同时，进行差异表达基因的筛选。选择在不同条件下的文库中表达量高，表达没有显著差异(p-value>0.05)的miRNA作为候选内参基因，参与稳定性评价。经上述筛选获得了5个在不同条件下表达量较高且较稳定的miRNA，并将其作为候选内参基因，进一步以百合杂交品种新铁炮百合和野生种岷江百合为实验材料对候选内参基因进行筛选。新铁炮百合(Lilium×formolongi)和岷江百合(L.regale)是性状优良、应用广泛的两种百合，二者分别是生长发育和抗病性研究的优良材料。新铁炮百合姿态优美，花色洁白，尤其不同于大部分百合的实生苗需要两到三年才可开花，新铁炮百合在一年中不需要春化处理即可开花，具有少有的较短营养生长，开花迅速的特性。而野生种岷江百合，实生苗开花时间为2-3年，但其抗病性尤其是对真菌病原体的抵抗力较强。在这两种百合中利用不同的方法对候选内参基因在不同实验条件(包括不同生长发育阶段、组织部位、非生物胁迫和生物胁迫)下的表达稳定性进行系统的评价，最终获得能够适用于尽可能多实验条件的优良的内参基因miRn46(成熟体的序列如SEQIDNO.1所示，前体序列如SEQIDNO.2所示)和miR399a(成熟体的序列如SEQIDNO.3所示，前体序列如SEQIDNO.4所示)，这两个miRNA作为内参基因的检测性能明显优于传统内参基因(5S，5.8S，U6等)。具体地，本专利技术提供以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种用于百合miRNA检测的内参基因，其具有如SEQIDNO.1-4任一所示的核苷酸序列。本专利技术提供的内参基因为miRNA，具体为miRn46和miR399a，其中，miRn46的成熟体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，前体序列如SEQIDNO.2所示，miR399a的成熟体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，前体序列如SEQIDNO.4所示。上述内参基因为用于百合miRNA相对水平检测的内参基因。miRn46和miR399a在百合不同生长发育阶段、组织部位、非生物胁迫和生物胁迫条件下均能够稳定表达，适于作为不同实验条件下的百合miRNA水平检测的内参基因。其中，miRn46适于作为新铁炮百合的miRNA相对水平检测的内参基因，而miR399a则更适于作为岷江百合的miRNA相对水平检测的内参基因。第二方面，本专利技术提供含有所述内参基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。第三方面，本专利技术提供用于扩增所述内参基因的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5-6所示或如SEQIDNO.6-7所示。对于内参基因miRn46，其扩增引物如SEQIDNO.5-6所示。对于内参基因miR399a，其扩增引物如SEQIDNO.6-7所示。上述引物用于扩增miRn46和miR399a具有较高的特异性和灵敏度。第四方面，本专利技术提供含有如SEQIDNO.5-6所示或如SEQIDNO.6-7所示引物的试剂盒。该试剂盒可用于百合miRNA相对水平的检测。可选的，所述试剂盒还含有选自PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、阳性对照、阴性对照中的一种或多种。第五方面，本专利技术提供所述内参基因或含有所述内参基因的生物材料或所述内参基因的扩增引物或含有所述引物的试剂盒在检测百合miRNA相对水平中的应用。优选地，本专利技术提供序列如SEQIDNO.1或2所示的内参基因在新铁炮百合miRNA相对水平检测中的应用。本专利技术还提供序列如SEQIDNO.3或4所示的内参基因在岷江百合miRNA相对水平检测中的应用。第六本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于百合miRNA检测的内参基因，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.1-4任一所示的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于百合miRNA检测的内参基因，其特征在于，其具有如SEQIDNO.1-4任一所示的核苷酸序列。


2.含有权利要求1所述的内参基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。


3.用于扩增权利要求1所述的内参基因的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5-6所示或如SEQIDNO.6-7所示。


4.试剂盒，其特征在于，其含有权利要求3所述的引物。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有选自PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、阳性对照、阴性对照中的一种或多种。


6.权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾桂霞，张倩，汪莲娟，高雪，赵玉倩，李介文，何恒斌，黄艺璇，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11