基于微流控芯片的超微注射法及其在高通量筛选中的应用制造技术

本发明专利技术公开了基于微流控芯片的超微注射法及其在高通量筛选中的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术将未包裹着微生物的单细胞空液滴进行筛除，通过超微注射的方式，在液滴形成后依然能微量注入皮升级别的试剂。可用于预筛选后加入酶偶联试剂，从而避免不必要的背景干扰和试剂浪费；可以避免在孵育期微生物细胞过早加入荧光反应试剂而发生的试剂降解或者副反应产生的高背景，从而提供了更多多样化微流控液滴筛选流程和模型。

【技术实现步骤摘要】
基于微流控芯片的超微注射法及其在高通量筛选中的应用
本专利技术涉及基于微流控芯片的超微注射法及其在高通量筛选中的应用，属于生物

技术介绍
近年来，随着微流控芯片技术的迅速发展，微流控技术逐步发展成一个全新的领域。微流控技术具有通量高、试剂消耗少和自动化程度高等优点，在生物学、医学、化学等多个领域都具有广泛应用，成为这些领域中关键的研究工具。目前，基于微流控技术的微液滴高通量筛选技术备受研究人员的关注，特别是对胞外分泌活性小分子物质和酶蛋白的筛选。然而因为根据泊松分布包裹微生物单细胞时，往往产生的液滴中包含大量空液滴，可高达95％，因此极大降低了筛选的通量。再者，在偶联酶促反应中，提早的包裹反应试剂与微生物一起孵育时，可能会产生以下几个问题：(1)直接将某些荧光标记物与细胞包裹于同一个液滴中，荧光标记物随着时间发生液滴间扩散，同时可能进入细胞发生酶促反应而产生高背景噪音；(2)某些试剂对细胞具有毒害作用，过早的加入会造成细胞生长受到影响；(3)采用直接包裹荧光标记物与细胞会造成荧光标记物的大量浪费，成本高，应用范围有限。
技术实现思路
针对目前存在的问题，本专利技术将超微注射应用于目的蛋白的筛选中，将未包括微生物的空液滴弃置，能实现液滴形成后依然能微量注入皮升级别的试剂，避免实际的浪费；使每个单细胞处于相同的液滴环境中，对待测菌株的生长状态不产生干扰，能够将每一个酶联反应固定在每一个微液滴中，每个液滴在一定时间内反应互不干扰。本专利技术提供了一种筛选突变体的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将荧光蛋白基因与目的蛋白突变体基因连接至同一载体上，转入宿主细胞，得到重组菌；(2)在微流控芯片上对重组菌细胞进行包埋得到单细胞液滴；(3)单细胞液滴的孵育，并筛选去除未包埋单细胞的空液滴；(4)将试剂注入单液滴中；(5)对注入试剂的单液滴进行筛选。在一种实施方式中，步骤(1)中所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白。在一种实施方式中，步骤(1)中所述宿主细胞为大肠杆菌。在一种实施方式中，所述步骤(2)为通过水相包裹油相的方式包埋细胞：调整菌液的浓度为每毫升108～109个细胞，水相的流速调整为1-5μL/min，油相的流速调整为5-10μL/min。在一种实施方式中，所述步骤(3)通过介电电泳，筛选得到包埋了细胞的液滴。在一种实施方式中，步骤(4)为将细胞至于微流控芯片中，在芯片进行超微注射的下方位置中植入导电电极，并连接电线，将电压设置为50-100V。在一种实施方式中，步骤(4)中所述试剂包括能被重组菌分解或者能与重组菌代谢产物结合产生第二种荧光，所述荧光与重组菌中所携带的载体上的荧光为不同的物质。在一种实施方式中，所述试剂的注射量为0.5-5pL。在一种实施方式中，注射量根据芯片结构和进样针进行调整。在一种实施方式中，进样针容量为40-60μL，内径0.10-0.20mm。在一种实施方式中，芯片超微注射进口宽为5-15μm，高为10-40μm。在一种实施方式中，将注入试剂的单液滴利用高通量筛选。本专利技术还提供了所述方法在筛选突变体中的应用。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术所提供的方法，能通过预分选弃置空液滴，并且能够微量注入皮升级别的试剂，减少了试剂的浪费。(2)通过液滴包裹后的微生物进入孵育模块，能使微生物在孵育模块中生长。(3)通过超微注射能够直接将某些酶偶联试剂加入液滴中，避免在孵育期微生物细胞过早加入荧光反应试剂而发生的试剂降解或者副反应产生的高背景，从而提供了更多多样化微流控液滴筛选流程和模型。协调液滴产生速度远远高于分选速度所带来的困扰。附图说明图1为本专利技术实施例的基于微流控芯片的单细胞液滴超微注射方法的原理图。图2为用于收集去除空液滴的玻璃收集瓶和孵育芯片图。具体实施方式超微注射部分所用仪器：微流控芯片(含电极)、微量进样器、注射泵、电压信号放大器；其中电信号放大器能够提供电压，使微液滴在通过电极时通过电击的方式使液滴不稳定，从而使注射液进入液滴；微流控芯片能为微液滴提供流动的通道，芯片上的电极与电压讯号器连接，产生电压；微量进样器将待注射液体注入液滴中；注射泵为微量进样器的注射提供动力。实施例1(1)在微流控芯片上生成微生物单细胞液滴将目的蛋白的编码基因与荧光蛋白连接至表达载体上构建得到重组质粒，将重组质粒转入宿主细胞中，得到重组菌。根据泊松分布原理，通过油相包裹水相的方式实现在微流控芯片每一个微液滴里包埋单个细胞。此时OD600设置为1，约为108到109个细胞每毫升菌液，水相的流速调整为1μL/min，油相的流速调整为5μL/min；油相为3MNovecHFE7500，含有0.5％Pico-surf表面活性剂。(2)排除空液滴由于步骤1中形成的液滴有部分可能会没有包裹上微生物，形成空液滴，需要进一步排除空液滴。将微生物在孵育池中孵育，实现微生物的扩增、荧光产物(用于标记微生物的荧光蛋白等)的生成。同时，在孵育池培养产生富集信号过程，也是协调液滴产生速度远远高于分选速度，而导致的两者之间的不平衡。在这一步孵育过程中由于不存在目标酶反应，因此不存在液滴进入孵育池带来的不同孵育时间导致的检测信号的差异，因此采用收集瓶或者孵育池(图2)。(3)含微生物的液滴进入孵育池孵育未包裹的微生物的空液滴由于无微生物，无法产生荧光蛋白，通过介电电泳被弃置，而包裹了微生物的液滴因带有荧光蛋白或者其他标记而被分选进入液滴收集池1；若微生物需要后培养，就将包裹了该微生物的液滴进入孵育芯片中孵育使细胞富集(对于低耗氧的微生物，也可以不需要采用孵育芯片，直接利用液相瓶进行孵育)；若该微生物不需要后培养，就直接进入超微注射模块。(4)液滴超微注射将孵育后的液滴或介电筛选得到的液滴进入超微注射模块，在芯片进行超微注射的下方位置中植入导电电极，并连接电线，将电压设置为50-100V，通过微液滴注射器将需添加试剂注射进入液滴中，比如所注射的试剂会被微生物分解或者能够与微生物代谢所产生的产物结合产生第二种荧光。(5)注射后的液滴再次孵育超微注射后的液滴进入孵育模块，使注射物质与微生物产物充分结合反应可释放荧光，则可通过荧光强度对各个微液滴中菌群产生产物的产量进行表征并实现高通量筛选。该方法使每个单细胞处于相同的液滴环境中，对待测菌株的生长状态不产生干扰，能够将每一个酶联反应固定在每一个微液滴中，每个液滴中的反应在一定时间内互不干扰。由于在第一轮弃置空液滴中采用荧光蛋白排除了空液滴干扰，将各样品收集池中取10μL样品进入血球计数板后，拍照计数液滴收集池2中绿色荧光液滴数小于5％，液滴收集池1中绿色荧光液滴数高于95％。而在液滴收集池3中荧光液滴数能控制5％左右，液滴收集池4中荧光液滴能控制在高于90％。实施例2：超微本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选突变体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n(1)将荧光蛋白基因与目的蛋白突变体基因连接至同一载体上，转入宿主细胞，得到重组菌；/n(2)在微流控芯片上对重组菌细胞进行包埋得到单细胞液滴；/n(3)单细胞液滴的孵育，并筛选去除未包埋单细胞的空液滴；/n(4)将试剂注入单液滴中；/n(5)对注入试剂的单液滴进行筛选。/n

【技术特征摘要】
1.一种筛选突变体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将荧光蛋白基因与目的蛋白突变体基因连接至同一载体上，转入宿主细胞，得到重组菌；
(2)在微流控芯片上对重组菌细胞进行包埋得到单细胞液滴；
(3)单细胞液滴的孵育，并筛选去除未包埋单细胞的空液滴；
(4)将试剂注入单液滴中；
(5)对注入试剂的单液滴进行筛选。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述宿主细胞包括大肠杆菌。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)为通过水相包裹油相的方式包埋细胞：调整菌液的浓度为每毫升108～109个细胞，水相的流速为1-5μL/min，油相的流速为5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，余世琴，肖志强，堵国成，陈坚，孙国运，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32