组织工程补片及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种组织工程补片及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：(1)在脱细胞支架的一侧表面接种目的细胞，在脱细胞支架的另一侧放置细胞焦亡产物，所述细胞焦亡产物与所述脱细胞支架另一侧表面分离；再将所述接种目的细胞的脱细胞支架和细胞焦亡产物共同在培养液中进行培养；(2)当所述目的细胞从所述脱细胞支架的一侧迁移到另一侧时，去除所述脱细胞支架一侧表面未迁移的目的细胞，得到组织工程补片；所述细胞焦亡产物为细胞焦亡后所产生的细胞焦亡分泌物、细胞焦亡提取物和焦亡细胞中的至少一种。本发明专利技术方法制备的组织工程补片具有高细胞负载量，目的细胞在支架中均匀分布并具有良好的生物学活性。

【技术实现步骤摘要】
组织工程补片及其制备方法
本专利技术涉及组织工程领域，特别是涉及一种组织工程补片及其制备方法。
技术介绍
干细胞治疗在实验和临床上都取得了良好的治疗效果，显示出了光明的应用前景。现在干细胞治疗领域的干细胞使用方式或干细胞递送的方式主要分为三类：1.干细胞直接注射；2.干细胞细胞片技术；3.组织工程补片技术。在这三类治疗手段各有利弊，使用干细胞注射操作简单易重复对患者损伤小，但是干细胞的有效使用率低，尤其是使用静脉注射作为干细胞递送方式时，大部分干细胞不能在受损组织处发挥治疗的作用，并且由于受损组织处的炎症环境，使少量在受损组织处黏附、归巢的干细胞无法良好的生长、增殖，无法在患处起到良好的治疗效果。细胞片法可以使干细胞在特定部位发挥治疗的作用，同时构建的细胞片富含细胞外基质的组成成分，为干细胞的生长、增殖提供了良好的微环境；为干细胞生物学功能的发挥提供了有利条件，但是单纯的细胞片结构无法为受损部位提供有效的机械支撑，且无论是单层细胞片还是复层细胞片都无法提供足够数量的干细胞用于受损组织的再生。所以组织工程补片技术就孕育而生，干细胞结合支架材料，组织工程补片不仅可以实现让干细胞在特定区域发挥治疗作用，还可以通过支架材料在患处提供有效的机械支撑，并且可以通过对支架材料进行改性，为细胞提供更有利于其生长、增殖和发挥生物学功能的微环境。相较于干细胞注射和干细胞片的干细胞递送方式，组织工程补片在组织再生治疗显示出更广泛的运用范围。现行常见的细胞与支架的构建技术包括：1.浸渍法；2.沉淀法；3.吸附法；4.凝胶法；5.动态培养系统法。浸渍法是将支架材料置于高密度细胞悬液中进行静置培养，使细胞黏附在支架上，这种静态培养方法的优点使操作简单，不易污染，缺点是细胞接种数量有限，接种率低，细胞只接种在表层。沉淀法又称接种法是最常用的构建方法，沉淀法主要包括一次沉淀法和二次沉淀法，主要构建方式是将细胞悬液缓缓的逐滴滴加于支架材料上，待细胞充分黏附于支架后再加入培养基进行培养，二次沉淀法是增加滴加细胞悬液的次数，以增加种子细胞的黏附数量。沉淀法的优势是操作简单，可以通过重复接种的方式提高细胞接种数量，缺点是接种细胞分布不均匀，并且接种率与支架的结构紧密相关。吸附法是近几年出现的细胞接种方式，一般采用负压吸附法，负压吸附法是将高密度细胞悬液滴加在支架材料上或将支架材料置于细胞悬液中后，对该细胞悬液支架体系置于负压容器中，施加一定的负压吸引力，使细胞被负压吸附在支架材料上。该构建方法的优点是有利于细胞黏附于支架材料内部，细胞接种较为均匀，且细胞接种量较多，局限是使用负压作为细胞迁移的动力负压太大易对细胞造成损伤且操作过程不易控制。凝胶法是将高密度细胞悬液与凝胶(例如胶原凝胶、纤维蛋白凝胶、细胞外基质胶)进行混合后制备形成细胞凝胶混合物后，黏附在支架材料表面。该方法的优势是使用凝胶包裹种子细胞在为细胞提供保护的同时为细胞的生长增殖提供了三维的空隙结构，但是缺点也同样明显凝胶只能贴敷在支架材料表面，而不能均匀分布在整个支架材料，并且凝胶为细胞迁移到支架内部形成阻力。动态培养系统法是将支架材料浸没于高密度细胞悬液中，采用旋转、离心、震荡的培养操作使细胞接种在支架材料上，动态培养系统相较于浸渍法和沉淀法可以使细胞更加均匀和更多的吸附在支架材料上且更有利于细胞向支架材料内部迁移，但是动态培养系统施加的物理因素的同时，旋转、离心和震荡同样会使黏附不紧密的细胞从支架中脱落下来，或对细胞造成损伤，影响种子细胞的接种率和种子细胞活性。虽然以上细胞构建技术可以实现种子细胞与支架材料相互复合的目的，但是接种后支架材料的细胞负载量低，细胞在支架材料内分布不均匀，以及在接种过程中如何保证种子细胞的质量仍是需要解决的问题。虽然组织工程补片技术具有广泛的运用场景和光明的前景，但是现有构建技术的不足，限制了组织工程补片的应用和治疗效果。在组织工程领域，良好的构建技术构建出的组织工程补片应具有以下技术要求：1.高细胞负载量，组织工程补片中应具有足够数量的种子细胞参与受损区域组织修复，足够数量的细胞是发挥种子细胞生物学作用和组织修复的基础。2.种子细胞在支架中均匀分布，均匀分布的细胞促进宿主对组织工程补片的整合是实现受损区组织连续、组织功能重现的基础。3.构建过程不会对种子细胞造成损伤，组织工程补片中的种子细胞具有良好生物学活性，在组织损伤部位可以存活、生长和增殖，且可以通过分化和旁分泌作用参组组织的再生和修复。因此，如何获得具有以上三种技术要求的构建手段成为组织工程亟待解决的重大课题。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的是提供一种组织工程补片的制备方法，其不会对目的细胞(种子细胞)造成损失，制备具有一定厚度的补片且所得组织工程补片具有高细胞负载量，目的细胞在支架中均匀分布并具有良好的生物学活性。具体技术方案如下：一种组织工程补片的制备方法，包括以下步骤：(1)在脱细胞支架的一侧表面接种目的细胞，在脱细胞支架的另一侧放置细胞焦亡产物，所述细胞焦亡产物与所述脱细胞支架另一侧表面分离；再将接种目的细胞的脱细胞支架和细胞焦亡产物共同在培养液中进行培养；(2)当所述目的细胞从所述脱细胞支架的一侧迁移到另一侧时，去除所述脱细胞支架一侧表面未迁移的目的细胞，得到组织工程补片；所述细胞焦亡产物为细胞焦亡后所产生的细胞焦亡分泌物、细胞焦亡提取物和焦亡细胞中的至少一种。在其中一些实施例中，所述目的细胞为间充质干细胞，其优选为羊膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。在其中一些实施例中，制备所述细胞焦亡产物的细胞为成纤维细胞、胶质细胞、间质细胞、胚胎干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和淋巴细胞中的至少一种。作为举例可以为骨髓间充质干细胞、心肌球干细胞或成纤维细胞。在其中一些实施例中，所述脱细胞支架的细胞去除率大于95％的脱细胞组织。在其中一些实施例中，所述脱细胞支架无免疫原性或低免疫原性的脱细胞组织。在其中一些实施例中，所述脱细胞支架为完整保留细胞外基质的脱细胞组织。在其中一些实施例中，所述脱细胞支架为脱细胞肝组织支架、脱细胞脂肪支架、脱细胞皮肤支架、脱细胞软骨支架、脱细胞心肌组织支架、脱细胞心包膜支架或脱细胞血管支架。在其中一些实施例中，所述细胞焦亡产物为细胞焦亡分泌物或细胞焦亡提取物时，所述细胞焦亡产物与凝胶混合后再置于脱细胞支架的另一侧。在其中一些实施例中，所述凝胶为天然多肽凝胶和天然生物凝胶中的至少一种；优选所述天然多肽水凝胶为纳米多肽水凝胶；优选所述天然生物凝胶优选为纤维蛋白凝胶、细胞外基质胶和胶原凝胶中的至少一种。在其中一些实施例中，所述细胞焦亡产物与凝胶混合后的混合物中的炎症因子蛋白浓度为1ng/ml～10mg/ml，优选为1ng/ml～1mg/ml。在其中一些实施例中，所述目的细胞为目的细胞片。进一步地，所述目的细胞片为单层目的细胞片或多层目的细胞片。在其中一些实施例中，所述脱细胞支架的厚度为0.1mm～50m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组织工程补片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)在脱细胞支架的一侧表面接种目的细胞，在脱细胞支架的另一侧放置细胞焦亡产物，所述细胞焦亡产物与所述脱细胞支架另一侧表面分离；再将接种目的细胞的脱细胞支架和细胞焦亡产物共同在培养液中进行培养；/n(2)当所述目的细胞从所述脱细胞支架的一侧迁移到另一侧时，去除所述脱细胞支架一侧表面未迁移的目的细胞，得到组织工程补片；/n所述细胞焦亡产物为细胞焦亡后所产生的细胞焦亡分泌物、细胞焦亡提取物和焦亡细胞中的至少一种。/n

【技术特征摘要】
1.一种组织工程补片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在脱细胞支架的一侧表面接种目的细胞，在脱细胞支架的另一侧放置细胞焦亡产物，所述细胞焦亡产物与所述脱细胞支架另一侧表面分离；再将接种目的细胞的脱细胞支架和细胞焦亡产物共同在培养液中进行培养；
(2)当所述目的细胞从所述脱细胞支架的一侧迁移到另一侧时，去除所述脱细胞支架一侧表面未迁移的目的细胞，得到组织工程补片；
所述细胞焦亡产物为细胞焦亡后所产生的细胞焦亡分泌物、细胞焦亡提取物和焦亡细胞中的至少一种。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述目的细胞为间充质干细胞，其优选为羊膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备所述细胞焦亡产物的细胞包括成纤维细胞、胶质细胞、间质细胞、胚胎干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和淋巴细胞中的至少一种。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞支架为细胞去除率高于95％、低免疫原性的脱细胞组织，其优选的脱细胞组织为脱细胞肝组织、脱细胞脂肪、脱细胞皮肤、脱细胞软骨、脱细胞心肌组织、脱细胞心包膜或脱细胞血管。


5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞焦亡产物为细胞焦亡分泌物或细胞焦亡提取物时，所述细胞焦亡产物与凝胶混合后再置于脱细胞支架的另一侧。


6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶为天然多肽凝胶和天然生物凝胶中的至少一种，所述天然多肽水凝胶为纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：武征，张中夏，梁锦超，林熙，张建华，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44