CD44抗体在制备治疗帕金森疾病的药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种CD44抗体在制备治疗帕金森疾病的药物中的应用。通过立体定位注射方法，向帕金森模型小鼠皮层部位注射CD44抗体（Anti‑CD44），发现该抗体可以显著缓解PD相关症状，如改善小鼠运动功能、恢复黑质部位多巴胺能神经元数量和抑制神经炎症。本发明专利技术效果好，研究方法简便。

【技术实现步骤摘要】
CD44抗体在制备治疗帕金森疾病的药物中的应用
本专利技术涉及一种CD44抗体的用途。
技术介绍
帕金森病(PD)又称为震颤性麻痹，是一种仅次于阿尔茨海默病的第二大神经退行性疾病。据统计，全世界每800人中就有1人患有帕金森，到2030年，由于老龄化进程的加速，帕金森患病率将翻一番，预计超过900万患者。患者每年的直接医疗费用预计超过10,000美元，对家庭和社会造成了沉重的负担。帕金森临床主要表现为行动迟缓、静止性震颤和动作僵化。其主要病理学特征为黑质部位多巴胺能神经元的减少。脑内产生多巴胺的细胞逐渐丧失了影响神经系统的功能，使患者控制肌肉的能力受到限制。临床PD的治疗，主要以多巴胺替代疗法为主，虽然在一定程度上能够改善PD患者的症状，但长期使用该疗法可引起多种不良反应，如不安、失眠、幻觉等精神症状。因此，进一步研究PD发生、发展的机制，寻找潜在治疗PD的靶点具有十分重要的科学意义和应用价值。目前，PD发病机制仍然不清楚，可能与蛋白质的异常积聚、炎症反应、线粒体功能紊乱和氧化应激有关。近年来，神经炎症作为帕金森病发病机制的重要切入点之一受到广泛关注。CD44是一种细胞粘附分子，是透明质酸的主要受体，也是细胞外基质的主要成分，其在内皮细胞、造血干细胞、间充质细胞以及肿瘤细胞表面均有表达。CD44主要参与异质性粘附，即肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的粘附，异质性粘附在肿瘤细胞侵袭转移中起促进作用。此外，CD44还充当TLR4的共受体传导的炎症调节剂来调节Toll样受体(TLR)的激活。专利
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种效果好的CD44抗体在制备治疗帕金森疾病的药物中的应用。本专利技术的技术解决方案是：一种CD44抗体在制备治疗帕金森疾病的药物中的应用。是在制备通过缓解运动功能障碍、改善MPTP所诱导的嗅觉功能障碍、提高TH的表达来治疗帕金森疾病的药物中的应用。一种研究CD44抗体治疗帕金森疾病作用机制的方法，其特征是：包括下列步骤：(1)抗体注射用75mg/kg苯巴比妥麻醉3月龄的B6野生型小鼠，通过立体定位进行单侧脑内注射，部位是在相对于前卤的前后正位AP0mm和中外侧ML-2mm以及距硬脑膜表面的背腹DV-1.5mm；使用10μL微量注射器将1μL1mg/ml的Anti-CD44以200nl/min的速率注射至小鼠脑皮层部位；对照小鼠以同样方法注射同等剂量的免疫球蛋白G；注射结束后，将针头保持在原部位3分钟保证吸收，再从小鼠大脑中缓慢移出针头，缝合头皮；(2)帕金森动物模型制备在立体定位注射后10天，用腹腔注射神经毒素MPTP方法诱导PD模型小鼠；在给药前三天，每天对小鼠进行转棒，爬杆一系列的行为学训练；分别将注射IgG和Anti-CD44的小鼠分为两组，一组为生理盐水组，另一组为MPTP组；接着对其行20mg/kg/dMPTP造模，连续注射一周，再进行行为学评估；与注射同等体积的生理盐水的对照小鼠相比，运动功能具有显著障碍的小鼠被认为是造模成功的PD模型小鼠，用于后续实验；(3)转棒实验使用加速旋转式旋仪进行转棒测试，用以检测运动协调性；将小鼠放在转棒上，4-40rpm加速模式持续5分钟，记录跌落前在转棒上保持平衡并连续运动的时间；重复三次，取平均值；(4)悬尾实验将小鼠尾巴后1/3部分固定在横杆上，使其距离地面15cm，计算每只小鼠在10min内静止的时间；(5)爬杆实验将动物放置在表面粗糙、垂直固定的直径15mm、长50cm杆子顶点，计算小鼠从顶点至两前肢碰到杆底部所花时间；每次检测间隔5分钟，检测3次取平均值；(6)嗅觉实验小鼠预先禁食20小时，准备干净笼盒并依次在干净垫料的中间、左上、右上、左下、右下五个位置埋入奶酪，将动物放入，计算小鼠找到奶酪的时间；若300s内没有找到，则记为300s，去除最小和最大值后进行统计分析；(7)黑质部位多巴胺能神元形态学分析利用组织化学方法对实验小鼠黑质部位酪氨酸羟化酶阳性细胞进行染色，主要操作步骤如下：1)取材的小鼠脑组织放于4％多聚甲醛中，放于4℃冰箱24小时；2)1XPB配制20％，30％蔗糖，依次脱水24小时，如组织未沉入底部适当将时间延长；3)脱水脑组织切片处理，调节厚度为12μm，37℃烘箱过夜，-20℃保存；4)染色前60℃烘片2小时，5)PBS洗3次，每次5分钟；封闭液封闭，37℃，30分钟；6)PBS洗2次，内源性过氧化氢酶阻断剂5分钟；7)PBS洗2次，非特异性染色阻断剂30分钟，37℃烘箱孵育；8.)与1:200TH抗体4℃孵育过夜；9)PBS洗2次，加生物素标记的羊抗鼠/兔IgG，37℃，1小时；10)PBS洗2次，加链霉卵白素-过氧化物酶，37℃，1小时；11)PBS洗2次，进行DAB显色；12)酒精脱水，依次为50％酒精，70％酒精，80％酒精，95％酒精两道，100％酒精两道，每道5分钟；13)无水乙醇和二甲苯，二甲苯透明三道，每道5分钟，中性树脂封片；后用显微镜观察拍照；TH阳性细胞数量用ImageJ软件统计分析；(8)黑质部位蛋白样品制备及表达水平检测组织裂解液配方：25mMTris-HCl，pH7.4；10mMNaF；10mMNa4P2O7；2mMNa3VO4；1mMEGTA；1mMEDTA；1％NP-40；10μg/mlLeupeptin；10μg/mlAprotinin；2mMPMSF；20nMOkadaicacid；用Polytron,PT2100台式匀浆器匀浆，样品于4℃旋转裂解1小时后13000rpm，4℃离心20分钟，离心后小心去除上层脂质，其余上清转至另一离心管并再次离心；这一过程重复2次以彻底去除蛋白样品中的脂质；样品蛋白含量用蛋白测定试剂盒测定，根据所得结果将所有样品的蛋白浓度调至相同水平，加入上样缓冲液，混匀后于100℃煮5分钟，冷却至室温用于westernblot分析；将上述步骤所得的样品用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并将胶上蛋白转至PVDF膜；转膜结束后的PVDF膜用含5％牛血清白蛋白的TBST缓冲液室温封闭1小时；封闭后的PVDF与一抗共孵4℃过夜；与一抗作用结束后，用TBST洗PVDF膜三次，再与二抗室温作用1小时；二抗作用结束后用TBST洗三次，最后PVDF膜用化学发光反应体系反应，并曝光至X胶片；各蛋白表达水平定量用软件Quantity-One分析；(9)黑质部位小胶质细胞、星胶质细胞形态学分析利用免疫荧光对实验小鼠黑质部位小胶质细胞、星胶质细胞进行染色，主要操作步骤如下：1)取材的小鼠脑组织放于4％多聚甲醛中，放于4℃冰箱24小时；2)1XPB配制20％，30％蔗糖，依次脱水24小时；3)脱水脑组织冰冻切片处理，调节厚度为30μm，37℃烘箱过夜，-20℃保存；4)染色前60℃烘片2小时，5)PBS洗3次，每次5分钟；6)封闭液封闭，37℃，30分钟；PBS洗2次，与1：300IBA-1/GFAP抗体4℃孵育过夜；7)PBS洗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CD44抗体在制备治疗帕金森疾病的药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种CD44抗体在制备治疗帕金森疾病的药物中的应用。


2.根据权利要求1所述的CD44抗体在制备治疗帕金森疾病的药物中的应用，其特征是：是在制备通过缓解运动功能障碍、改善MPTP所诱导的嗅觉功能障碍、提高TH的表达来治疗帕金森疾病的药物中的应用。


3.一种研究CD44抗体治疗帕金森疾病作用机制的方法，其特征是：包括下列步骤：
(1)抗体注射
用75mg/kg苯巴比妥麻醉3月龄的B6野生型小鼠，通过立体定位进行单侧脑内注射，部位是在相对于前卤的前后正位AP0mm和中外侧ML-2mm以及距硬脑膜表面的背腹DV-1.5mm；使用10μL微量注射器将1μL1mg/ml的Anti-CD44以200nl/min的速率注射至小鼠脑皮层部位；对照小鼠以同样方法注射同等剂量的免疫球蛋白G；注射结束后，将针头保持在原部位3分钟保证吸收，再从小鼠大脑中缓慢移出针头，缝合头皮；
(2)帕金森动物模型制备
在立体定位注射后10天，用腹腔注射神经毒素MPTP方法诱导PD模型小鼠；在给药前三天，每天对小鼠进行转棒，爬杆一系列的行为学训练；分别将注射IgG和Anti-CD44的小鼠分为两组，一组为生理盐水组，另一组为MPTP组；接着对其行20mg/kg/dMPTP造模，连续注射一周，再进行行为学评估；与注射同等体积的生理盐水的对照小鼠相比，运动功能具有显著障碍的小鼠被认为是造模成功的PD模型小鼠，用于后续实验；
(3)转棒实验
使用加速旋转式旋仪进行转棒测试，用以检测运动协调性；将小鼠放在转棒上，4-40rpm加速模式持续5分钟，记录跌落前在转棒上保持平衡并连续运动的时间；重复三次，取平均值；
(4)悬尾实验
将小鼠尾巴后1/3部分固定在横杆上，使其距离地面15cm，计算每只小鼠在10min内静止的时间；
(5)爬杆实验
将动物放置在表面粗糙、垂直固定的直径15mm、长50cm杆子顶点，计算小鼠从顶点至两前肢碰到杆底部所花时间；每次检测间隔5分钟，检测3次取平均值；
(6)嗅觉实验
小鼠预先禁食20小时，准备干净笼盒并依次在干净垫料的中间、左上、右上、左下、右下五个位置埋入奶酪，将动物放入，计算小鼠找到奶酪的时间；若300s内没有找到，则记为300s，去除最小和最大值后进行统计分析；
(7)黑质部位多巴胺能神元形态学分析
利用组织化学方法对实验小鼠黑质部位酪氨酸羟化酶阳性细胞进行染色，主要操作步骤如下：1)取材的小鼠脑组织放于4％多聚甲醛中，放于4℃冰箱24小时；2)1XPB配制20％，30％蔗糖，依次脱水24小时，如组织未沉入底部适当将时间延长；3)脱水脑组织切片处理，调节厚度为12μm，37℃烘箱过夜，-20℃保存；4)染色前60℃烘片2小时，5)PBS洗3次，每次5分钟；封闭液封闭，37℃，30分钟；6)PBS洗2次，内源性过氧化氢酶阻断剂5分钟；7)PBS洗2次，非特异性染色阻断剂30分钟，37℃烘箱孵育；8.)与1:200TH抗体4℃孵育过夜；9)PBS洗2次，加生物素标记的羊抗鼠/兔IgG，37℃，1小时；10)PBS洗2次，加链霉卵白素-过氧化物酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙诚，王玥珺，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32