一种促进膝关节软骨细胞增殖的方法技术

一种促进膝关节软骨细胞增殖的方法，包括如下步骤：步骤1、建立动物性KOA模型；步骤2、按照人和动物体表面积换算出动物体表面积比率，确定所用动物膝关节处所需铁包金按摩膏的用量，并在动物膝关节处采用刮痧法涂抹相关量的铁包金按摩膏；步骤3、间隔一日重复步骤2，重复次数为8

【技术实现步骤摘要】
一种促进膝关节软骨细胞增殖的方法


[0001]本专利技术涉及一种关节炎的治疗方法，特别是一种促进膝关节软骨细胞增殖的方法。

技术介绍

[0002]膝关节骨性关节炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是一种以膝关节表面软骨损伤以及继发性的软骨下骨质增生为主要病理特点的慢性、渐进性、退行性的骨关节病，其主要的临床表现有关节疼痛、肿胀、功能受限等，中晚期甚至出现关节畸形及功能丧失。随着人民生活水平的提高，人口肥胖比率不断上升，以及人口老龄化的加剧，KOA的发病率逐年上升。国内外最新统计结果显示，KOA在40岁人群的发病率为10％～17％，60岁以上则达50％，而在75岁以上人群中发病率达到80％甚至更高。膝骨性关节炎严重影响了患者的生活质量，也给社会以及家庭带来沉重的负担。因此，寻找新型安全有效的治疗方法具有重大意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是克服现有技术的上述不足而提供一种促进膝关节软骨细胞增殖的方法，它可成功获取原代软骨细胞，可一定程度上促进膝关节软骨细胞增殖，为膝关节骨性关节炎的治疗提供了一条更加安全、可行的途径。
[0004]本专利技术的技术方案是：一种促进膝关节软骨细胞增殖的方法，包括如下步骤：
[0005]步骤1、建立动物性KOA模型；
[0006]步骤2、按照人和动物体表面积换算出动物体表面积比率，确定所用动物膝关节处所需铁包金按摩膏的用量，并在动物膝关节处采用刮痧法涂抹相关量的铁包金按摩膏；
[0007]步骤3、间隔一日重复步骤2，重复次数为8
‑
12次。
[0008]本专利技术进一步的技术方案为：所述步骤2中的刮痧法具体操作步骤具体包括：
[0009](1)单手握持刮痧板，将板放置掌心，一侧由拇指固定，另一侧由食指和中指固定，远心端与皮肤呈45
°
沿下肢长轴方向从上向下刮拭，移动范围在5cm以内，力度以皮色不变，可有轻微发热感而无皮肤破损为度，约为20
‑
30N；
[0010](2)刮痧频率为20
‑
40次/分钟，操作时间平均8
‑
10min，刮至皮肤微微发红，不出丘疹点即可。
[0011]进一步，所述步骤1中的动物性KOA模型的具体建立方法具体包括：
[0012](1)将动物固定在仰卧位，并固定双后肢，再进行耳缘静脉注射麻醉，右后膝内侧部备皮后，微屈膝关节，用碘伏消毒；
[0013](2)以髌骨内侧下缘为进针点，消毒后使用注射器穿刺，将针头沿穿刺点送入关节腔内，再将相应剂量的木瓜蛋白酶溶液注入，于造模开始第1、4、7天注射，每天一次，总共3次；
[0014](3)术后分笼饲养，注意观察动物的饮食等情况，定期驱赶动物20
‑
40min/次，造模2周后即可出现KOA改变；
[0015](4)造模8周后随机从模型组中取一只模型动物进行空气栓塞处死，暴露双膝关节，切断交叉韧带，去除半月板，大体观察对比股骨髁及胫骨平台软骨情况，当模型动物膝关节可见软骨表面变白、粗糙、缺损，有明显关节腔积液，证明兔KOA造模成功。
[0016]进一步，所述步骤2中的铁包金按摩膏的成分包括铁包金、大黄、生川乌、生草乌、木瓜、木鳖子、肉桂、白蔹、赤芍、透骨草、乳香和没药。
[0017]进一步，所述步骤3结束后所用KOA模型中的膝关节软骨细胞是否增殖及增殖量的判断是先采用软骨细胞分离和培养，然后采用甲苯胺染色鉴定软骨细胞，最后再采用Western
‑
Blot印迹分析检测TRPV6蛋白、Sox9蛋白表达情况；检测TRPV6蛋白、关节软骨细胞细胞外基质中COL
‑Ⅰ
、COL
‑Ⅱ
的表达情况；检测Sox9蛋白、关节软骨细胞细胞外基质中COL
‑Ⅹ
的表达情况，采用CCK
‑
8法检测软骨细胞增殖。
[0018]进一步，所述软骨细胞分离和培养的具体操作包括：
[0019](1)从关节处分离出软骨组织，用锐剪刀将其剪成体积小于1mm3的组织块；
[0020](2)用含双抗的冷PBS液反复吹打清洗2
‑
3次，静置后，弃去上层液体及漂浮组织，将剩余组织移入离心管中，往离心管中加3倍体积的0.25％胰蛋白酶，置入30
‑
40℃的恒温摇床中，振荡消化15
‑
20分钟，静置5
‑
10分钟；
[0021](3)弃上清，加入0.2％胶原酶II，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化30
‑
60分钟；将消化过的组织通过100μm细胞筛过滤，用磷酸缓冲液(PBS)冲洗标本，按照20000个/cm2的密度接种于组织培养瓶中，接着加入5
‑
10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，内含1％青霉素/链霉素，放入37℃、体积分数5％CO2、95％湿度的恒温二氧化碳培养箱中培养；
[0022](4)培养2天后换液，以后每隔2
‑
3天换1次液。
[0023]进一步，所述采用甲苯胺染色鉴定软骨细胞的具体步骤包括：
[0024](1)取原代关节软骨细胞；吸出培养基，PBS漂洗三次，每次5
‑
10分钟；
[0025](2)在室温下用1
‑
4％中性甲醛固定20
‑
40分钟，再用PBS漂洗2
‑
4次，每次2
‑
4分钟；
[0026](3)加入甲苯胺蓝液3
‑
8min，稍水洗，入冰醋酸液分化，直到胞核和颗粒清晰；
[0027](4)稍水洗，用冷风吹干；
[0028](5)置于二甲苯中5
‑
15min后，中性树胶封片、显微镜观察。
[0029]进一步，所述CCK
‑
8法检测软骨细胞增殖的具体操作包括：
[0030](1)取软骨细胞，消化计数，以3*104个细胞/孔密度接种于96孔板内；
[0031](2)设0、1、3和5天共四个时间点，每个时间点做三个复孔，按照接种处理后，到达相应的时间点后每孔加10μl/孔的Cck8混合溶液；
[0032](3)5％CO2孵育箱中放置40
‑
90min，温度保持35
‑
40℃；
[0033](4)Bio
‑
Tek酶标仪分析450nm处吸光度(OD)值；
[0034](5)取均值并绘制生长曲线。
[0035]进一步，所述步骤1中选用的建模动物包括小白鼠、新西兰大白兔及其他小型的哺乳性动物。
[0036]进一步，所述步骤1中的建模动物在术前先动物房内适应不少于5天后再采用木瓜蛋白酶关节腔注射术造模。
[0037]本专利技术的有益效果：
[0038](1)本专利技术采用铁包金按摩膏结合刮痧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进膝关节软骨细胞增殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、建立动物性KOA模型；步骤2、按照人和动物体表面积换算出动物体表面积比率，确定所用动物膝关节处所需铁包金按摩膏的用量，并在动物膝关节处采用刮痧法涂抹相关量的铁包金按摩膏；步骤3、间隔一日重复步骤2，重复次数为8
‑
12次。2.根据权利要求1所述的促进膝关节软骨细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤2中的刮痧法具体操作步骤具体包括：(1)单手握持刮痧板，将板放置掌心，一侧由拇指固定，另一侧由食指和中指固定，远心端与皮肤呈45
°
沿下肢长轴方向从上向下刮拭，移动范围在5cm以内，力度以皮色不变，可有轻微发热感而无皮肤破损为度，约为20
‑
30N；(2)刮痧频率为20
‑
40次/分钟，操作时间平均8
‑
10min，刮至皮肤微微发红，不出丘疹点即可。3.根据权利要求1所述的促进膝关节软骨细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤1中的动物性KOA模型的具体建立方法具体包括：(1)将动物固定在仰卧位，并固定双后肢，再进行耳缘静脉注射麻醉，右后膝内侧部备皮后，微屈膝关节，用碘伏消毒；(2)以髌骨内侧下缘为进针点，消毒后使用注射器穿刺，将针头沿穿刺点送入关节腔内，再将相应剂量的木瓜蛋白酶溶液注入，于造模开始第1、4、7天注射，每天一次，总共3次；(3)术后分笼饲养，注意观察动物的饮食等情况，定期驱赶动物20
‑
40min/次，造模2周后即可出现KOA改变；(4)造模8周后随机从模型组中取一只模型动物进行空气栓塞处死，暴露双膝关节，切断交叉韧带，去除半月板，大体观察对比股骨髁及胫骨平台软骨情况，当模型动物膝关节可见软骨表面变白、粗糙、缺损，有明显关节腔积液，证明兔KOA造模成功。4.根据权利要求1所述的促进膝关节软骨细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤2中的铁包金按摩膏的成分包括铁包金、大黄、生川乌、生草乌、木瓜、木鳖子、肉桂、白蔹、赤芍、透骨草、乳香和没药。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的促进膝关节软骨细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤3结束后所用KOA模型中的膝关节软骨细胞是否增殖及增殖量的判断是先采用软骨细胞分离和培养，然后采用甲苯胺染色鉴定软骨细胞，最后再采用Western
‑
Blot印迹分析检测TRPV6蛋白、Sox9蛋白表达情况；检测TRPV6蛋白、关节软骨细胞细胞外基质中COL
‑Ⅰ
、COL
‑Ⅱ
的表达情况；检测Sox9蛋白、关节软骨细胞细胞外基质中COL
‑Ⅹ
的表达情况，采用CCK
‑
8法检测软骨细胞增殖。6.根据权利要求5所述的促进膝关节软骨细胞增殖的方法，其特征在于，所述软骨细胞分离和培养的具体操作...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡建军，蔡萍，戎宽，匡浩铭，杨惠，胡余飞，曹闲雅，谭学松，沈琳玲，
申请(专利权)人：湖南省中医药研究院，
类型：发明
国别省市：