一种筛选具有抗衰老潜力天然产物的方法技术

本发明专利技术涉及一种筛选具有抗衰老潜力天然产物的方法，该方法经过两轮筛选，且每轮筛选中需要控制衰老细胞的密度和培养时间在适当的范围内，进而，可以简便、快速且准确地筛选获得具有抗衰老潜力的天然产物。得具有抗衰老潜力的天然产物。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选具有抗衰老潜力天然产物的方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种筛选具有抗衰老潜力天然产物的方法。

技术介绍

[0002]细胞衰老是指真核细胞一种相对稳定且通常不可逆的细胞周期停滞的状态，在这种状态下增殖细胞会对促生长刺激产生耐受，通常由DNA损伤等胁迫性信号所引起。上个世纪60年代，美国科学家Leonard Hayflick首先描述了细胞衰老的存在和特征，他观察到人类胚胎成纤维细胞(WI38)最终会停止分裂，但在长时间培养后仍然具有活力和代谢活性。这一现象后来被称为复制性衰老，是指正常细胞在大约30
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50次分裂(即“Hayflick极限”)后会停止连续分裂。复制性衰老本质上由端粒渐进缩短所诱导。在每一轮的DNA复制中，端粒都会逐渐缩短，最终达到一个临界长度，阻止进一步复制，从而停止细胞分裂。较短的无帽端粒会引起DNA损伤应答，通常直接触发衰老。
[0003]现在普遍认为，除了具有干细胞样特性的细胞类型外，只有转化的(包括恶性)细胞会无限复制，而非转化细胞则不会。衰老细胞与静息细胞和终末分化细胞均不同，其中静息细胞能够重新进入细胞周期。衰老细胞的特征是形态学异常、代谢活性变化、染色质重构、基因表达改变、脂褐素增加、颗粒性明显、空泡化严重以及出现一种称为衰老相关分泌表型(senescence
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associated secretory phenotype,SASP)的促炎症表型。由于核纤层lamin B1表达丧失，可观察到核膜完整性破坏。同时，衰老细胞积累功能失调的线粒体，并表现出活性氧种属(ROS)水平升高。还可观察到溶酶体内含物增加和溶酶体活性改变，表现为pH为6.0时β
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半乳糖苷酶染色阳性率上升，使其成为广被采用的细胞衰老标志物。衰老的生物学作用比较复杂，衰老细胞的保护作用和有害作用均已有描述，主要取决于病理生理学环境。例如，尽管衰老可能作为避免受损细胞恶性转化的机制进化而来，但衰老的发生可能会导致许多年龄相关病变，包括癌症、心脑血管疾病、骨质疏松、关节炎、代谢性疾病、神经退行性症状等一系列危害人类健康与寿命的临床问题。
[0004]细胞衰老表现为核膜内折，染色质固缩，细胞体积增大，激活下游包括p53、p16
INK4A
/Rb、PI3K/Akt、FoxO转录因子和线粒体SIRT3/4/5等在内的多条信号通路。除了进入永久性增殖停滞，衰老细胞常关系到许多病理学特征，包括局部炎症。细胞衰老发生于受损细胞，并防止其在生物体内增殖。在各种外界刺激和内部因素影响下，细胞损伤达到一定程度则可以导致明显的细胞衰老迹象。当损伤累积达到一定的时间，组织中呈现各种肉眼可辨的组织退行变化和生理上的衰老表型。
[0005]尤其值得注意的是，衰老细胞中炎症性细胞因子的表达水平显著升高，这一现象被称为衰老相关分泌表型(SASP)。SASP这一概念是由Coppe等人于2008年首次提出。他们发现衰老细胞能通过分泌胞外基质蛋白、炎症相关因子及癌细胞生长因子促进邻近癌前细胞发生癌变或恶性程度加剧，并称这些蛋白为SASP因子。
[0006]衰老细胞主要通过3个途径参与机体的各种生理和病理过程：(1)衰老细胞基因表达和形态改变逐步累积可影响相应组织的功能；(2)衰老细胞限制干细胞和未分化祖细胞
的再生潜能，导致组织再生能力下降；(3)衰老细胞不仅表现为生长周期停滞，还通过自分泌和旁分泌途径释放大量的细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶等，影响邻近细胞和组织的微环境，导致和加速机体衰老及相关疾病，近年大量研究表明在这一过程中SASP起到核心的病理作用。此外，衰老细胞分泌的这些因子还会影响周围的正常细胞，而抑制SASP则能够延缓机体衰老、延缓各种相关疾病。典型的SASP因子包括肿瘤坏死因子
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α(TNF
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α)、白细胞介素6(IL
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6)、白细胞介素8(IL
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8)、白细胞介素1a(IL
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1a)、基质金属蛋白酶(MMP)、粒细胞
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巨噬细胞集落刺激因子(GM
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CSF)和纤溶酶原激活物抑制因子
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1(PAI1)等，这些因子促进免疫系统激活，导致组织微环境中衰老细胞等异常因素被机体清除，进而发挥肿瘤抑制功能。然而，十分矛盾的是，SASP尚可通过特定分泌因子(如VEGF,ANGPTL4)促进血管生成、细胞外基质重塑或上皮
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间质转化(epithelial
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to
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mesenchymal transition,EMT)的因子来促进肿瘤发展。此外，衰老诱导的慢性炎症可引起系统性免疫抑制，这种慢性炎症还可促进衰老相关的组织损伤和变性、器官功能失调和癌症等多种衰老相关疾病的发生和发展。
[0007]DNA损伤、端粒功能障碍、癌基因激活、氧化应激等刺激均可诱导细胞出现SASP，其机制与转录级联、自分泌环路和持续DNA损伤反应密切相关。但是，过表达或者抑制衰老经典通路p53和p16
INK4A
/Rb不能影响SASP的表达，表明尽管衰老细胞的周期停滞和SASP经常协同发生，两者的调控通路并不完全重叠。据报道，DNA损伤反应通过激活毛细血管扩张共济失调突变基因、奈梅亨断裂综合征蛋白1和检测点激酶2增加SASP因子IL
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6和IL
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8的分泌。DNA损伤反应(DDR)在细胞受损后立即被激活，衰老细胞出现成熟SASP则需要约1周甚至更长的时间，并且短暂的DNA损伤反应并不能诱导细胞衰老，也不能诱导SASP，表明除了DNA损伤反应外还存在其它机制共同诱导SASP。
[0008]研究表明，DDR、p38MAPK和mTOR信号作为上游驱动因子，NF
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κB和c/EBPβ作为下游转录因子，均被发现参与到衰老细胞SASP的调节过程中。NF
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κB和c/EBPβ转录因子在细胞衰老时活性增加，参与调节细胞应激和炎症信号的细胞因子表达。细胞衰老时磷酸化的NF
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κB/RelA亚基入核，与SASP启动基因结合，调控SASP因子表达，因此NF
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κB通常被称为SASP的主调节器。小鼠肝脏、肾脏及老年人大脑组织的衰老细胞中锌指转录因子4(GATA4)水平较高，GATA4可以通过调节衰老细胞中NF
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κB的活性影响SASP相关基因IL
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6、IL
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8、CXCL1的表达。p38MAPK是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，是重要的信号转导分子，激活或者阻断p38MAPK足以影响衰老细胞SASP形成。p38MAPK在衰老程序开始几天后被激活，通过活化丝裂原和应激激活的蛋白激酶
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MSK1和MSK2，间接激活NF
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κB，使得p65和p50在核内聚集，这与SASP早期发展本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选具有抗衰老潜力天然产物的方法，其包括：(1)将候选天然产物与衰老细胞进行第一接触处理，之后将未经过所述第一接触处理的衰老细胞和经过所述第一接触处理后的衰老细胞进行细胞增殖检测，同时将对照细胞和经过所述第一接触处理后的衰老细胞进行细胞凋亡检测，所述第一接触处理是在96孔板中进行的，所述第一接触处理中所述衰老细胞的密度为4500
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5500个/孔(优选5000个/孔)，所述第一接触处理的时间为5
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10天(优选7天)，所述衰老细胞是通过将所述对照细胞进行衰老诱导处理后获得的；所述细胞增殖检测和细胞凋亡检测后，同时满足以下条件的候选天然产物为初筛天然产物：A、所述细胞增殖检测后，经过所述第一接触处理后的衰老细胞与未经过所述第一接触处理的衰老细胞相比，检测结果具有显著性差异(P<0.05)；B、所述细胞凋亡检测后，经过所述第一接触处理后的衰老细胞与对照细胞相比，检测结果具有显著性差异(P<0.05)；(2)将所述初筛天然产物与衰老细胞进行第二接触处理，之后将未经过所述第二接触处理的衰老细胞和经过所述第二接触处理后的衰老细胞进行细胞增殖检测，同时将对照细胞和经过所述第二接触处理后的衰老细胞进行细胞凋亡检测，所述第二接触处理是在96孔板中进行的，所述第二接触处理中所述衰老细胞的密度为15000
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25000个/孔(优选20000个/孔)，所述第二接触处理的时间为25
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35天(优选30天)，所述衰老细胞是通过将所述对照细胞进行衰老诱导处理后获得的；所述细胞增殖检测和细胞凋亡检测后，同时满足以下条件的初筛天然产物为目标天然产物：A、所述细胞增殖检测后，经过所述第二接触处理后的衰老细胞与未经过所述第二接触处理的衰老细胞相比，检测结果具有显著性差异(P<0.05)；B、所述细胞凋亡检测后，经过所述第二接触处理后的衰老细胞与对照细胞相比，检测结果具有显著性差异(P<0.05)。2.权利要求1的方法，其中，所述衰老处理为化疗药物处理或辐射处理；优选地，所述化疗药物为博莱霉素(BLEO)；更优选地，所述博莱霉素(BLEO)的处理浓度为40
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60μg/mL(优选50μg/mL)；或者，所述对照细胞为人源前列腺原代基质细胞系(如PSC27)；或者，所述第一接触处理和所述第二接触处理的培养基为DMEM(10％FBS)。3.权利要求1的方法，其中，所述第一接触处理中，所述候选天然产物的浓度为1μM
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l mM(优选1μM
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50μM)；或者，所述第二...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宇，许奇霞，张旭光，贺瑞坤，
申请(专利权)人：汤臣倍健股份有限公司，
类型：发明
国别省市：