用于吸入的细胞外囊泡制造技术

具有亲水的中性聚合物如PEG或PSA的涂层的囊泡，包括外泌体，与未涂覆的囊泡相比，具有增强的形成悬浮液或胶体的能力。这使得涂覆的囊泡能够用于形成气雾剂液滴，使得包含囊泡的液体制剂可以在雾化器中用于吸入给药。这种涂覆的囊泡还能够穿过粘液并将其载物递送到肺细胞中。来源于间充质干细胞的外泌体可以将其他蛋白质、miRs、mRNAs和其他核酸序列递送至肺细胞，从而为CF、COPD肺癌和其他肺部疾病提供再生基因疗法。再生基因疗法。再生基因疗法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于吸入的细胞外囊泡


[0001]本专利技术涉及细胞外囊泡，特别是外泌体、含有囊泡的组合物、其用途以及使用方法和制造方法。本专利技术还涉及这种囊泡在治疗和基因治疗中的用途，特别是用于治疗呼吸道疾病，例如囊性纤维化(CF)、COPD和肺癌。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡是被脂质双分子层包裹并被大多数原核细胞和真核细胞主动分泌的纳米级膜状囊泡。细胞外囊泡包括外泌体、微囊泡和膜泡。
[0003]通常，囊泡是通过活细胞的胞吐作用形成的。外泌体与许多其他细胞外囊泡的不同之处在于它们起源于细胞的内吞区室，并在多囊泡体与细胞膜融合时通过胞吐作用从细胞中排出。
[0004]多囊泡体的形成是一个逐步过程，该过程从早期内体的形成开始。这些早期内体成熟为晚期内体，并且在此过程中，数种载物，无论是将在溶酶体区室中破坏的还是将被分类成小囊泡分泌的，通过内体膜的内陷被选择性地带入内体内部，并逐渐形成大量腔内囊泡(intraluminal vesicles)。这些具有许多腔内囊泡的内体被称为晚期内体，然后成熟形成MVBs，最终与细胞膜融合作为外泌体释放这些囊泡。
[0005]细胞外囊泡的大小通常在高达约1000nm的范围内，外泌体的大小通常在30
‑
150nm的范围内。除了其标志性的膜分子外，囊泡(包括外泌体)天然地还具有囊泡载物，载物包括水溶液/悬浮液中的各种蛋白质、RNAs和微RNAs。
[0006]囊泡，特别是外泌体，参与细胞间通讯和细胞间信号转导。因此，外泌体和其他囊泡最近已开始用于实验疾病模型中以递送药物或所需分子。由于其天然来源，外泌体作为递送各种基于治疗学的核酸、大分子和药物的有效且可靠的手段，比脂质体基的药物递送具有明显的优势。
[0007]囊泡在细胞质核心中携带蛋白质、RNA和微RNAs的能力使其成为方便的药物输送工具。另外，脂质双分子层的存在提供了结构的完整性，保护了核酸免于降解并使外泌体能够承受剪切应力。
[0008]已知外泌体能够容易地穿透细胞膜并逃避免疫系统，部分是由于它们的大小。由于外泌体是天然存在的纳米囊泡，它们不具有如脂质体或其他基于药物载体的纳米颗粒可能具有的细胞毒性作用，并具有更好的循环半衰期和更好的穿透各种生物屏障的能力。
[0009]囊性纤维化(CF)是一种遗传性疾病，其中患者在囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)蛋白的基因的两个复制(copy)中均具有遗传突变。CFTR参与各种分泌物的生产，特别是粘液、消化液和汗液。尽管这种分泌通常很稀薄，但由于囊性纤维化患者发生突变，分泌物却很浓稠。在肺中，这种浓稠的分泌物会导致大量痰液产生，粘液清除率降低，由于粘液堆积而导致气道阻塞、持续咳嗽、肺部频繁感染以及呼吸困难。
[0010]尽管目前尚无治疗CF的已知方法，但基因治疗正在被探索为可能的潜在治疗方法。已经尝试了多种用于基因治疗的方法，包括脂质体和病毒载体。然而，已经发现这类治
疗方法效率低下，这主要是由于载体效率低下和安全问题。病毒载体可能引起不良的免疫反应，从而阻碍重复给药，并且还可能通过病毒DNA与宿主基因组的整合而引起潜在的致癌性插入突变。
[0011]由于CF引起严重的肺部问题，因此将基因疗法有效地递送至肺部被认为是有效疗法的必要条件。
[0012]囊泡，包括外泌体，似乎是基因治疗以及肺部其他治疗方法(例如再生医学、蛋白质、抗体或基于小分子的治疗方法)的理想的肺部递送载体。但是至少有两个重大困难。首先，肺中的粘液为任何基因转移载体到达肺细胞提供了重大的屏障。粘液是一种粘稠的粘弹性胶体，可在包括眼睛、鼻子、肺、胃肠道和女性生殖道在内的各种进入人体的部位保护其免受病原体、毒素和碎屑的侵害。许多纳米颗粒具有很强的粘膜粘附性，并有效地滞留在被迅速清除的外周粘液层中，从而极大地限制了它们在整个粘膜中的分布以及向下层组织的渗透。测试病毒基因载体(包括腺病毒(AdV)和腺相关病毒(AAV)血清型2)和用于吸入基因治疗的非病毒脂质体载体的临床试验，未能提供临床上的显着效果，因为基因转移至气道上皮的效率低，产生治疗失活的宿主免疫反应且在脂质体基因治疗的情况下，递送充分的剂量是另一个公认的挑战。各种研究表明，粘液捕获会阻止这些载体进入下面的上皮细胞，从而阻止成功的基因转移。这些捕获的颗粒的滞留时间受到外围粘液层周转率的限制，周转率取决于器官，范围从几秒到几小时。为了确保经由粘液膜有效递送包括药剂的颗粒，此类颗粒必须能够容易地扩散通过粘液屏障，避免粘液粘附并逃避粘液纤毛清除防御。此外，一旦穿过粘液屏障，还必要穿过细胞膜屏障。细胞膜屏障也旨在提供屏障来防止进入细胞，特别是防止病毒和外来颗粒进入细胞。
[0013]在重复给药后，病毒载体还可以通过现有的免疫反应或通过获得性免疫反应被无效。使用具有免疫豁免的干细胞外泌体或EVs可以绕开此问题。PEG涂层可以通过有效地屏蔽表面抗原来进一步提高干细胞外泌体的隐身特性。
[0014]此外，对于许多标准喷雾器而言，喷雾递送治疗有关剂量的囊泡可能是有问题的。水性纳米悬浮液或胶体中的囊泡可以聚集或凝聚。特别是在浓缩的纳米流体中粒子间力导致粘度增加，从而在雾化给药中造成了很大的困难。另外，聚集或凝聚导致囊泡没有形成真正的悬浮液或胶体，因为囊泡没有散布在整个流体中，而是结块在一起或粘附到其中容纳纳米悬浮液或胶体的血管的管壁上。
[0015]载物，特别是核苷酸序列和蛋白质，向肺部气道上皮细胞的有效递送仍然是所有方法的普遍问题。
[0016]Kooijmans等人“PEG化并具有靶向功能的细胞外囊泡表现出增强的细胞特异性和循环时间”，《控制释放杂志》，卷224，2016年1月7日，第77
‑
85页(PEGylated and targeting extracellular vesicles display enhanced cell specificity and circulation time”,Journal of Controlled Release,vo.224,7January 2016,p77
‑
85)描述了用与聚乙二醇偶联的靶向配体修饰细胞外囊泡，以提高囊泡的特异性并延长其在清除前在循环系统中的时间。该论文介绍了小鼠神经母细胞瘤细胞的细胞外囊泡的生产，并没有解决粘液渗透或细胞膜渗透的问题。实际上，该论文暗示了PEG化会对细胞摄取产生不利影响。
[0017]Myung Soo Kim，“工程化的巨噬细胞源性外来体，可将紫杉醇靶向肺转移：体外和体内评估”，《纳米医学》：纳米技术，生物学和医学，第14卷。1号2017年10月1日，第195
‑
204
页(“Engineered macrophage
‑
derived exosomes for targeting paclitaxel delivery to pulmonary metastases:in vitro and in vivo evalua本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种可雾化的组合物，包含来自间充质干细胞(MSCs)的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡具有亲水性聚合物聚乙二醇(PEG)的表面涂层，所述囊泡载有包含微RNA(miR)、anti
‑
miR、mRNA、长链非编码RNA、环状RNA、小干扰RNA、短发夹RNA、piwi相互作用RNA、CRISPR RNA序列、上述的修饰或人工设计的核酸序列、蛋白质、细胞因子或脂质的载物。2.根据权利要求1的组合物，其中所述囊泡是外泌体。3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述亲水性聚合物包括DSPE
‑
PEG。4.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述表面涂层覆盖所述外泌体的表面的至少65％。5.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述表面涂层聚合物的分子量小于5kDa，优选小于3kDa。6.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述外泌体具有包含微RNA(miR)的载物。7.根据权利要求6的组合物，其中所述miR选自miR
‑
125b
‑
5p、miR
‑
125b
‑1‑
3p、miR
‑
513a
‑
5p和miR
‑
17；茎环(pre
‑
microRNA)序列hsa
‑
mir
‑
125b
‑
1可能会过表达，从而产生同时包含miR
‑
125b
‑1‑
3p和miR
‑
125b
‑
5p成熟序列的E...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰拉德，
申请(专利权)人：欧姆尼斯普兰特有限公司，
类型：发明
国别省市：