三元复合物种类的连续形成制造技术

用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法，其包括以下步骤：(a)提供具有引发的模板核酸、聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；(b)检查容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括聚合酶和结合在所述引发的模板核酸的碱基位置处的所述第一碱基类型的核苷酸同源物；(c)将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，由此所述容器保留来自步骤(b)的所述引发的模板核酸和所述聚合酶；(d)检查容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括所述聚合酶和结合在所述引发的模板核酸的碱基位置处的所述第二碱基类型的核苷酸同源物；以及(e)鉴定在所述引发的模板核酸的所述碱基位置处的核苷酸的类型。酸的所述碱基位置处的核苷酸的类型。酸的所述碱基位置处的核苷酸的类型。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】三元复合物种类的连续形成
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请基于2018年7月24日提交的美国临时申请第62/702,468号，并要求保护其权益，所述申请通过引用整体并入本文。
[0003]专利技术背景
[0004]本公开总体上涉及核酸的检测，并且对核酸测序技术具有特定的适用性。
[0005]模板核酸链的准确序列测定对于分子诊断非常重要。从替代物中鉴定已知位置处的单核苷酸碱基可作为分析单核苷酸多态性(即，“SNP”)的基础。SNP反过来可用于确定个体的表型，诸如对疾病的易感性或对具有所需性状的倾向性。检测患者的遗传变体可以表明某些药物治疗患者的疗效，或表明使用某些药物治疗患者时出现不良副作用的风险。
[0006]商购可得的核酸测序平台极大地增加了我们对可操作性状的遗传基础的了解。测序生物化学和检测硬件的改进仍在继续进行。然而，许多平台仅实现了相对较短的读取。大规模并行处理允许获得许多短读取(short read)，然后将其编织在一起，组装成较大的基因组序列。例如，可将数百万个各自的长度仅为数百个核苷酸的读取组装在一起，得到约30亿个核苷酸长的人基因组。通过增加测序读取长度，可以减少实现DNA的大规模并行处理和数据的高通量组装所需的时间和资源。本专利技术解决了这种需要，并且还提供了相关的有利方面。

技术实现思路

[0007]本公开提供了用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法。所述方法可包括以下步骤：(a)提供具有引发的模板核酸、聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；(b)检查容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第一碱基类型的核苷酸同源物；(c)将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，由此所述容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和聚合酶；(d)检查容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第二碱基类型的核苷酸同源物；以及(e)鉴定在引发的模板核酸的碱基位置处的核苷酸的类型。任选地，步骤(c)包括从容器中移出第一碱基类型的核苷酸同源物，并将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至容器，由此所述容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和聚合酶。作为该选择的替代方案，无需移除第一碱基类型的核苷酸同源物；并且作为替代，容器可保留步骤(c)和(d)中的第一碱基类型的核苷酸同源物。
[0008]在一些实施方案中，用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法可包括以下步骤：(a)提供具有引发的模板核酸、聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；(b)检查容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第一碱基类型的核苷酸同源物；(c)将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，由此所述容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和聚合酶；(d)检查容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第二碱基类型的核苷酸同源物；(e)鉴定在引发的模板核酸的碱基位置处的核苷酸的
类型；(f)将第三碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，由此所述容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和聚合酶；以及(g)检查容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第三碱基类型的核苷酸同源物。任选地，所述方法还包括以下步骤：(h)将第四碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，由此所述容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和聚合酶；和(i)检查容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第四碱基类型的核苷酸同源物。
[0009]本公开提供了用于对引发的模板核酸测序的方法，其包括以下步骤：(a)提供具有引发的模板核酸、第一聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；(b)检查容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括第一聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第一碱基类型的核苷酸同源物；(c)将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，由此所述容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和第一聚合酶；(d)检查容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括第一聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第二碱基类型的核苷酸同源物；(e)鉴定在引发的模板核酸的碱基位置处的核苷酸的类型；(f)将第三碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，由此所述容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和第一聚合酶；(g)检查容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括第一聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第三碱基类型的核苷酸同源物；(h)将第四碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，由此所述容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和第一聚合酶；(
ⅰ
)检查容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括第一聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第四碱基类型的核苷酸同源物；(j)将核苷酸添加到引发的模板核酸的引物中，由此所述容器包含延伸的引发的模板核酸；(k)将第二聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器；以及(l)使用延伸的引发的模板代替引发的模板核酸并使用第二聚合酶代替第一聚合酶重复步骤(b)至(i)。第一聚合酶可以是与第一类型相同的类型的聚合酶，或者第一聚合酶和第二聚合酶可以是不同类型的聚合酶。
[0010]用于对引发的模板核酸测序的方法可以包括以下步骤：(a)提供具有引发的模板核酸、第一聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；(b)检查容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括第一聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第一碱基类型的核苷酸同源物；(c)将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，由此所述容器保留来自步骤(b)的引发的模板核酸和第一聚合酶；(d)检查容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括第一聚合酶和结合在引发的模板核酸的碱基位置处的第二碱基类型的核苷酸同源物；(e)鉴定在引发的模板核酸的碱基位置处的核苷酸的类型；(f)将核苷酸添加到引发的模板核酸的引物中，由此所述容器包含延伸的引发的模板核酸；(g)将第二聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器；以及(h)使用延伸的引发的模板代替引发的模板核酸并使用第二聚合酶代替第一聚合酶重复步骤(b)至(e)。第一聚合酶可以是与第一类型相同的类型的聚合酶，或者第一聚合酶和第二聚合酶可以是不同类型的聚合酶。
[0011]本公开还提供了用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法，其包括以下步骤：(a)提供引发的模板核酸的阵列；(b)形成稳定的三元复合物，所述三元复合物各自包括聚
合酶、第一碱基类型的核苷酸同源物和阵列中的引发的模板核酸；(c)检测阵列中的稳定的三元复合物；(d)对第二碱基类型的核苷酸同源物重复步骤(b)和(c)，由此引发的模板核酸和聚合酶保留在阵列中；以及(e)鉴定存在于步骤(c)中检测到的每一种稳定的三元复合物中的核苷酸的类型。任选地，步骤(d)包括从阵本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法，所述方法包括(a)提供引发的模板核酸的阵列；(b)将第一碱基类型的多种核苷酸同源物和多种聚合酶递送至所述阵列，从而形成稳定的三元复合物，所述三元复合物各自包括所述多种聚合酶中的聚合酶、所述第一碱基类型的所述多种核苷酸同源物中的核苷酸和所述阵列中的引发的模板核酸；(c)检测所述阵列中包括所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物的所述稳定的三元复合物；(d)在来自步骤(b)的聚合酶存在的情况下将第二碱基类型的多种核苷酸同源物递送至所述阵列，从而形成稳定的三元复合物，所述三元复合物各自包括来自步骤(b)的所述聚合酶中的聚合酶、所述第二碱基类型的所述多种核苷酸同源物中的核苷酸和所述阵列中的引发的模板核酸；(e)检测所述阵列中包括所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物的所述稳定的三元复合物；以及(f)鉴定存在于步骤(c)中检测到的每一种所述稳定的三元复合物中的核苷酸的类型。2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括使用第三碱基类型的核苷酸同源物代替所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物重复步骤(d)和(e)。3.如权利要求2所述的方法，所述方法还包括使用第四碱基类型的核苷酸同源物代替所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物重复步骤(d)和(e)。4.如权利要求2所述的方法，所述方法还包括在步骤(d)之前除去所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物的步骤，由此所述引发的模板核酸和所述聚合酶保留在所述阵列中。5.如权利要求4所述的方法，其中通过用包含至少10％至至多50％乙醇的水溶液洗涤所述阵列来除去所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物。6.如权利要求1所述的方法，其中所述第一碱基类型的核苷酸同源物在步骤(e)中保留在所述阵列中。7.如权利要求1所述的方法，其中所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物包含外源标记物，并且所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物包含外源标记物。8.如权利要求7所述的方法，其中所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物的所述外源标记物产生与由所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物的所述外源标记物产生的信号不同的信号。9.如权利要求8所述的方法，其中步骤(e)还包括区分来自所述不同外源标记物的不同信号。10.如权利要求7所述的方法，其中所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物上的所述外源标记物产生的信号与由所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物上的所述外源标记物产生的信号相同。11.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括(g)将核苷酸添加到每个所述引发的模板核酸的引物中，由此所述阵列包含延伸的引发的模板核酸；(h)使用延伸的引发的模板代替所述引发的模板核酸重复步骤(b)至(f)。12.如权利要求11所述的方法，其中第二聚合酶将所述核苷酸添加到每个所述引发的
模板核酸的所述引物中，并且其中所述聚合酶和所述第二聚合酶是相同类型的聚合酶。13.如权利要求11所述的方法，其中所述引物包含可逆终止子部分，且其中步骤(g)包括解封闭所述引物并将所述核苷酸添加到每个所述引发的模板核酸的解封闭的引物中，由此所述阵列包含延伸的引发的模板核酸。14.一种用于鉴定引发的模板核酸中的核苷酸的方法，其包括(a)提供包含引发的模板核酸、聚合酶和第一碱基类型的核苷酸同源物的容器；(b)检查所述容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括所述聚合酶和结合在所述引发的模板核酸的碱基位置处的所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物；(c)将第二碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，由此所述容器保留来自步骤(b)的所述引发的模板核酸和所述聚合酶；(d)检查所述容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括所述聚合酶和结合在所述引发的模板核酸的碱基位置处的所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物；以及(e)鉴定在所述引发的模板核酸的碱基位置处的核苷酸的类型。15.如权利要求14所述的方法，其中步骤(c)包括从所述容器中除去所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物，并将所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物递送至所述容器，由此所述容器保留来自步骤(b)的所述引发的模板核酸和所述聚合酶。16.如权利要求15所述的方法，其中通过用包含至少10％至至多50％乙醇的水溶液洗涤所述容器来除去所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物。17.如权利要求14所述的方法，其中所述容器还保留步骤(c)和(d)中的所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物。18.如权利要求14所述的方法，其中将所述引发的模板核酸固定在固体载体上。19.如权利要求18所述的方法，其中所述引发的模板核酸是固定于阵列中的多种不同的引发的模板核酸之一，并且其中实施所述方法以鉴定每个所述不同的引发的模板核酸中的碱基位置处的核苷酸的类型。20.如权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物包含外源标记物，并且所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物包含外源标记物。21.如权利要求20所述的方法，其中所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物的所述外源标记物不同于所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物的所述外源标记物。22.如权利要求21所述的方法，其中步骤(d)还包括区分来自所述不同外源标记物的信号。23.如权利要求21所述的方法，其中所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物上的所述外源标记物产生与所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物上的所述外源标记物相同的信号。24.如权利要求14至23中任一项所述的方法，所述方法还包括(f)将第三碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，由此所述容器保留来自步骤(b)的所述引发的模板核酸和所述聚合酶；以及(g)检查所述容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括所述聚合酶和结合在所述引发的模板核酸的所述碱基位置处的所述第三碱基类型的所述核苷酸同源物。25.如权利要求24所述的方法，所述方法还包括
(h)将第四碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，由此所述容器保留来自步骤(b)的所述引发的模板核酸和所述聚合酶；以及(i)检查所述容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括所述聚合酶和结合在所述引发的模板核酸的所述碱基位置处的所述第四碱基类型的所述核苷酸同源物。26.如权利要求25所述的方法，所述方法还包括(j)将核苷酸添加到所述引发的模板核酸的所述引物中，由此所述容器包含延伸的引发的模板核酸；(k)将第二聚合酶和所述第一碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器；以及(l)使用所述延伸的引发的模板代替所述引发的模板核酸并使用所述第二聚合酶代替所述聚合酶重复步骤(b)至(i)。27.如权利要求14至26中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述容器还包含第三碱基类型的核苷酸同源物，并且其中步骤(b)包括检查所述容器是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括所述聚合酶和(i)结合在所述引发的模板核酸的所述碱基位置处的所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物或(ii)结合在所述引发的模板核酸的所述碱基位置处的所述第三碱基类型的所述核苷酸同源物。28.如权利要求27所述的方法，其中所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物包含外源标记物，并且所述第三碱基类型的所述核苷酸同源物包含外源标记物。29.如权利要求28所述的方法，其中所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物的所述外源标记物不同于所述第三碱基类型的所述核苷酸同源物的所述外源标记物。30.如权利要求29所述的方法，其中步骤(b)还包括区分来自所述不同外源标记物的信号。31.如权利要求28所述的方法，其中所述第一碱基类型的所述核苷酸同源物上的所述外源标记物产生与所述第三碱基类型的所述核苷酸同源物上的所述外源标记物相同的信号。32.如权利要求31所述的方法，其中步骤(b)包括检测所述信号。33.如权利要求14至32中任一项所述的方法，其中步骤(c)还包括将第四碱基类型的核苷酸同源物递送至所述容器，并且其中步骤(d)包括检查所述容器中是否有稳定的三元复合物，所述三元复合物包括所述聚合酶和(i)结合在所述引发的模板核酸的所述碱基位置处的所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物或(ii)结合在所述引发的模板核酸的所述碱基位置处的所述第四碱基类型的所述核苷酸同源物。34.如权利要求33所述的方法，其中所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物包含外源标记物，并且所述第四碱基类型的所述核苷酸同源物包含外源标记物。35.如权利要求34所述的方法，其中所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物上的所述外源标记物不同于所述第四碱基类型的所述核苷酸同源物上的所述外源标记物。36.如权利要求35所述的方法，其中步骤(b)还包括区分来自所述不同外源标记物的信号。37.如权利要求34所述的方法，其中所述第二碱基类型的所述核苷酸同源物上的所述外源标记物产生与所述第四碱基类型的所述核苷酸同源物上的所述外源标...

【专利技术属性】
技术研发人员：布列塔尼，
申请(专利权)人：欧姆尼欧美公司，
类型：发明
国别省市：