生物反应性组合物及其使用方法技术

本文提供了无毒的生物反应性的非天然氨基酸及其使用方法等等。基酸及其使用方法等等。基酸及其使用方法等等。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物反应性组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
[0001]本申请案主张2018年3月8日申请的第62/640,450号美国申请案的优先权，所述美国申请案的公开内容以引用的方式并入本文中。关于在联邦政府资助的研究和开发下所进行专利技术的权利的声明
[0002]本专利技术是在美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)颁发的授予号R01 GM118384和MH114079下利用政府支持进行的。政府拥有本专利技术的某些权利。

技术介绍

[0003]蛋白质的氨基酸侧链通常不能彼此形成共价键，除了半胱氨酸，半胱氨酸会产生弱而可逆的二硫键。因此，蛋白质主要使用蛋白质内部或蛋白质之间的非共价相互作用。对细胞无毒并能够与多个天然氨基酸残基反应的一种潜在的生物反应性的非天然氨基酸将大大扩展体内适于共价键合的蛋白质的多样性。通过扩展适合于体内共价键合的蛋白质的多样性，有可能通过利用新型共价键来增强现有的蛋白质特性或发展新的功能。此外，在蛋白质之间形成共价键的能力将允许在体内不可逆转地捕获蛋白质
‑
蛋白质相互作用，这可用于蛋白质鉴定、药物靶标发现或生物治疗学。
[0004]本文尤其提供在本领域中这些和其它需求的解决方案。

技术实现思路

[0005]在一方面，提供了一种生物分子缀合物，其包括通过生物缀合物接头与第二生物分子部分缀合的第一生物分子部分，其中所述生物缀合物接头具有下式：
[0006]一方面，提供了具有以下的非天然氨基酸侧链的蛋白质：在一些方面，该蛋白质进一步包含在该非天然氨基酸侧链附近的赖氨酸、组氨酸、酪氨酸或其两种或更多种的组合。
[0007]在一个方面，提供了式(I)的蛋白质：
其中R1和R2各自独立地是肽基部分。
[0008]在一个方面，提供了式(II)的蛋白质：其中R1和R2各自独立地是肽基部分。
[0009]在一个方面，提供了式(III)的蛋白质：其中R1和R2各自独立地是肽基部分。
[0010]在一个方面，提供了一种蛋白质，其包含式(A)的部分、式(B)的部分、式(C)的部分或其两种或更多种的组合：
[0011]在一个方面，提供了一种吡咯赖氨酰
‑
tRNA合成酶，其在SEQ ID NO：3的突变体吡咯赖氨酰
‑
tRNA合成酶的底物结合位点内包括至少5个氨基酸残基取代。
[0012]一方面，提供了一种载体，其包含编码如本文所述的突变体吡咯赖氨酰
‑
tRNA合成酶的核酸序列。
[0013]一方面，提供了一种复合物，其包含本文所述的吡咯赖氨酰
‑
tRNA合成酶和氟硫酸酯
‑
L
‑
酪氨酸(FSY)。
[0014]在一个方面，提供了一种细胞，其包含氟硫酸酯
‑
L
‑
酪氨酸(FSY)；如本文所述的生物分子缀合物；如本文所述的FSY生物分子；如本文所述的吡咯赖氨酰
‑
tRNA合成酶；如本文所述的载体；或本文所述的复合物。在一些方面，细胞是细菌细胞或哺乳动物细胞。
[0015]本文中更详细地描述本公开的这些和其它实施方案和方面。
附图说明
[0016]图1A
‑
1E.在大肠杆菌中将FSY基因编码至蛋白质中。图1A：FSY的结构。图1B：方案显示了FSY和天然亲核残基(缩写为Nu)之间的附近实现的SuFEx反应。图1C：SDS
‑
PAGE，其显示FSY掺入大肠杆菌中的Afb(36TAG)。图1D：完整Afb
‑
36FSY的ESI
‑
TOF MS光谱。图1E：Z
‑
24FSY的串联MS光谱。
[0017]图2A
‑
2C.将FSY遗传编码至哺乳动物细胞中的蛋白质中。图2A：在HeLa细胞中将FSY掺入EGFP
‑
182TAG的FACS分析。图2B：从相同数量的HeLa
‑
EGFP
‑
182TAG报告基因细胞测量的总EGFP荧光强度。误差条：s.e.m.，n＝6。图2C：HeLa
‑
EGFP
‑
182TAG报告基因细胞的荧光图像。
[0018]图3A
‑
3D.FSY通过SuFEx直接在大肠杆菌细胞中交联近端Lys、His和Tyr。图3A：Afb
‑
Z复合物的结构，显示了两个近端位点用于FSY和靶残基X的掺入。图3B：上图：大肠杆菌细胞裂解物的蛋白质印迹；下图：从大肠杆菌纯化的His
‑
tag蛋白的SDS
‑
PAGE。图3C
‑
3D：MBP
‑
Z
‑
24FSY/Afb
‑
7Lys的串联MS谱(图3C)和MBP
‑
Z
‑
24FSY/Afb
‑
7His(图3D)。
[0019]图4A
‑
4C.FSY通过SuFEx在大肠杆菌细胞内分子交联Tyr。图4A：CaM的结构，显示了用于FSY和靶Tyr的位点。纯化的CaM
‑
76FSY
‑
80Tyr的(图4B)SDS
‑
PAGE和(图4C)串联MS谱。
[0020]图5A
‑
5C.FSY通过SuFEx分子间交联Tyr。(图5A)与PAPS还原酶复合的Trx1的结构，显示了FSY位点和天然Tyr191。用PAPS还原酶交联的Trx1的(图5B)SDS
‑
PAGE和(图5C)串联MS谱。
[0021]图6提供了在存在或不存在1mM FSY的情况下在37℃下大肠杆菌DH10B细胞的生长曲线。重复实验三次。
[0022]图7显示了将AzF掺入EGFP
‑
182TAG HeLa报告基因细胞的FACS分析。
[0023]图8显示了用各种浓度的FSY孵育的HeLa
‑
EGFP
‑
182TAG报告基因细胞和293T细胞的细胞活力测定。误差条代表s.e.m.；n＝3。
[0024]图9显示了在pH 7.4和8.0下用PAPS还原酶交联的Trx62FSY的SDS
‑
PAGE分析。
[0025]图10提供了活细胞中FSY行为的图示。
[0026]图11提供了配体
‑
受体界面，其显示了hGH上的FSY掺入位点(Q68)和hGH受体上的靶标残基Lys166
[0027]图12是hGH(FSY)与hGH受体的胞外结构域结合的蛋白质印迹分析。
[0028]图13是如实施例2中所述，通过hGH(FSY)或hGH(WT)刺激后，BAF3细胞中pSTAT5产生的蛋白质印本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生物分子缀合物，其包含通过生物缀合物接头与第二生物分子部分缀合的第一生物分子部分，其中所述生物缀合物接头具有下式：2.根据权利要求1所述的生物分子缀合物，其中所述生物分子缀合物具有下式：R1‑
L1‑
A
‑
X1‑
L2‑
R2；其中：A是所述生物缀合物接头；R1是第一生物分子部分；R2是第二生物分子部分；L1是键或第一共价接头；L2是键或第二共价接头；和X1是
–
NR5‑
、
‑
O
‑
、
‑
S
‑
或其中环A是取代或未取代的杂亚芳基或取代或未取代的杂亚环烷基，并且其中A中的氮连接至所述生物缀合物接头；和R5是氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基；其中R1和R2任选地连接在一起以形成分子内缀合的生物分子缀合物。3.根据权利要求2所述的生物分子缀合物，其中L1是键、
‑
S(O)2‑
、
‑
NR
3A
‑
、
‑
O
‑
、
‑
S
‑
、
‑
C(O)
‑
、
‑
C(O)NR
3A
‑
、
‑
NR
3A
C(O)
‑
、
‑
NR
3A
C(O)NR
3B
‑
、
‑
C(O)O
‑
、
‑
OC(O)
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；L2是键、
‑
S(O)2‑
、
‑
NR
4A
‑
、
‑
O
‑
、
‑
S
‑
、
‑
C(O)
‑
、
‑
C(O)NR
4A
‑
、
‑
NR
4A
C(O)
‑
、
‑
NR
4A
C(O)NR
4B
‑
、
‑
C(O)O
‑
、
‑
OC(O)
‑
、被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚环烷基、被取代或未被取代的亚杂环烷基、被取代或未被取代的亚芳基或被取代或未被取代的亚杂芳基；和R
3A
、R
3B
、R
4A
和R
4B
独立地是氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的环烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基或被取代或未被取代的杂芳基。4.根据权利要求2所述的生物分子缀合物，其中X1是
‑
NH
‑
、
‑
O
‑
或亚咪唑基。5.根据权利要求1所述的生物分子缀合物，其中所述第一生物分子部分是肽基部分、核酸部分或碳水化合物部分。6.根据权利要求5所述的生物分子缀合物，其中第一生物分子部分是肽基部分；且其中
所述肽基部分通过赖氨酸、组氨酸或酪氨酸共价键合至所述生物缀合物接头。7.根据权利要求1所述的生物分子缀合物，其中所述第二生物分子部分是肽基部分、核酸部分或碳水化合物部分。8.根据权利要求7所述的生物分子缀合物，其中第二生物分子部分是肽基部分；且其中所述肽基部分通过赖氨酸、组氨酸或酪氨酸共价键合至所述生物缀合物接头。9.根据权利要求2所述的生物分子缀合物，其中
–
L1‑
R1是肽基部分、核酸部分或碳水化合物部分。10.根据权利要求2所述的生物分子缀合物，其中
–
L2‑
R2是肽基部分、核酸部分或碳水化合物部分。11.根据权利要求1所述的生物分子缀合物，其中所述生物缀合物接头是分子间接头。12.根据权利要求1所述的生物分子缀合物，其中所述生物缀合物接头是分子内接头。13.式(I)、式(II)或式(III)的蛋白质：其中R1和R2各自独立地是肽基部分；和其中R1和R2任选地连接在一起以形成分子内缀合的蛋白质。14.根据权利要求13所述的蛋白质，其中所述蛋白质具有式(I)。15.根据权利要求13所述的蛋白质，其中所述蛋白质具有式(II)。16.根据权利要求13所述的蛋白质，其中所述蛋白质具有式(III)。17.根据权利要求13所述的蛋白质，其中R1和R2每个独立地包含蛋白质α链或蛋白质β链。18.根据权利要求13所述的蛋白质，其中R1和R2连接在一起形成分子内缀合的蛋白质。
19.根据权利要求13所述的蛋白质，其中R1和R2不连接在一起。20.一种吡咯赖氨酰
‑
tRNA合成酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：