一种阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，包括96孔酶标板、酶标记抗体、阿奇霉素标准品、20×浓缩洗涤液、复溶液工作液、底物A液、底物B液、终止液，所述96孔酶标板上包被有阿奇霉素半抗原‑载体蛋白，所述酶标记物浓缩液为辣根过氧化物酶标记的阿奇霉素特异性抗体。本发明专利技术还提供了阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒在检测牛奶、蜂蜜样本中的应用。本发明专利技术阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒结构简单、使用方便、对检测人员要求低，且本发明专利技术试剂盒检测灵敏度高，检测结果的准确度和精密度等技术餐顺均较好，是非常理想的阿奇霉素残留检测产品。

【技术实现步骤摘要】
一种阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒及其应用
本专利技术生物技术检测领域，具体涉及一种阿奇霉素酶联免疫快速检测试剂盒及其应用。
技术介绍
阿奇霉素(azithromycin，AZM)为半合成十五元大环内酯类抗生素，是20世纪80年代研发的。阿奇霉素具有良好的广谱抗菌效果，广泛用于人呼吸道、泌尿道和软组织感染和性传播疾病的预防和治疗，也曾用于畜禽疾病的临床治疗。2005年8月农业部发布560号公告，阿奇霉素属于人医临床控制使用的抗菌药，将其用于食品动物，会产生耐药性问题，影响动物疫病控制、食品安全和人类健康，不符合兽药安全有效审批原则，将阿奇霉素药物列为禁用兽药。虽然阿奇霉素在畜禽中禁用，但是因其具有良好的药代动力学特点，及抗菌效果好，在利益驱使下，仍然存在违规使用的现象。动物可食性组织中阿奇霉素的残留，对人类安全造成了一定的隐患。目前，阿奇霉素的检测主要为液相色谱法、液相色谱串联质谱法等，而且多集中在制药原料、血液等中的检测。仪器分析法，虽然具有检测结果准确，结果更可靠，重复性好等特点，但是其前处理程序繁琐，测定时间长，仪器成本高，对检测人员要求高，不利于现场快速检测。
技术实现思路
为克服现有技术的缺点，本专利技术的目的是提供一种检测灵敏度高，现场检测反应时间短，检测简便的阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，能够实现现场大量样本的快速筛查。本专利技术技术方案：本专利技术阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒包括96孔酶标板、酶标记抗体工作液、阿奇霉素标准品、20×浓缩洗涤液、复溶工作液、底物A液、底物B液、终止液，其中96孔酶标板上包被有阿奇霉素半抗原-OVA偶联物，酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记的阿奇霉素特异性抗体。其中，阿奇霉素标准品为0μg/L，0.02μg/L，0.06μg/L，0.18μg/L，0.54μg/L，1.62μg/L。其中，20×浓缩洗涤液的成分是含2％吐温-20，0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0。其中，复溶工作液的成分是2％氯化钠溶液。其中，底物A液为过氧化氢，底物B液为TMB。其中，终止液为2mol/LH2SO4。进一步地，阿奇霉素半抗原结构式为由以下步骤得到：1)称取阿奇霉素1.0g，用20mL丙酮与20mL吡啶溶解，搅拌均匀。2)称取马来酸酐0.5g加入步骤1)溶液，80℃条件下搅拌，反应6h后停止，蒸干后上硅胶柱，洗脱液为石油醚:乙酸乙酯＝1:1，分离纯化，得阿奇霉素半抗原。所述阿奇霉素抗体由阿奇霉素半抗原-BSA偶联物作为免疫原制备得到。本专利技术的另一个目的，还提供了一种阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒在检测牛奶、鸡肉样本中的应用。酶联免疫检测试剂盒检测具体步骤为：牛奶、鸡肉样本的处理；用本专利技术阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒检测；分析检测结果。本专利技术有益效果：本专利技术阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒建立了直接竞争ELISA方法检测阿奇菌素残留。本专利技术阿奇菌素酶联免疫检测试剂盒对阿奇霉素的检测灵敏度高达0.02μg/L，对牛奶、鸡肉样本的回收率在89～111％之间，板内变异系数小于5％，板间变异系数小于6％。本专利技术技术方案的阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒结构简单，检测灵敏度高，精密度和准确度等技术参数均较好，检测成本低，对检测人员要求不高，检测产品便携性好，适用于大批量样本的现场快速筛查，是理想的阿奇霉素残留检测产品。附图说明图1阿奇霉素半抗原合成路线图图2阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒标准曲线图具体实施方式为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本专利技术的特征和优点，而不是对本专利技术权利要求的限制，本专利技术试剂如无特别说明，均为常规试剂，均可由市场购买得到。实施例一1、阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒包含组分：(1)96孔酶标板，酶标板上包被有阿奇霉素半抗原-OVA偶联物；(2)辣根过氧化物酶标记的阿奇霉素单克隆抗体，7mL/瓶；(3)阿奇霉素标准品0μg/L，0.02μg/L，0.06μg/L，0.18μg/L，0.54μg/L，1.62μg/L，1mL/瓶。(4)20×浓缩洗涤液，成分含2％吐温20，0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0，百分比为质量体积比，30mL/瓶，使用时用去离子水按1:19的比例进行稀释。(5)复溶液工作液，成分为2％氯化钠溶液，百分比为质量体积比，50mL/瓶。(6)底物A液为过氧化氢，底物B液为TMB，均为7mL/瓶。(7)终止液为2mol/LH2SO4，7mL/瓶。2、主要组分制备：2.1、阿奇霉素半抗原的合成称取阿奇霉素原料药1.0g，用20mL丙酮和20mL吡啶溶解，搅拌均匀，向其中加入马来酸酐0.5g，80℃搅拌反应6h后停止，蒸干后上硅胶柱，使用石油醚:乙酸乙酯＝1:1的洗脱液洗脱，分离纯化，得阿奇霉素半抗原1.0g。2.2、免疫原与包被原合成免疫原为阿奇霉素半抗原-BSA，包被原为阿奇霉素半抗原-OVA，制备过程如下：称取阿奇霉素半抗原15mg溶解于1mLDMF中，得到阿奇霉素半抗原稀释液；称取20mgEDC和10NHS溶解于0.2mL蒸馏水中，然后将其加入阿奇霉素半抗原稀释液中，室温搅拌反应30min，得到活化阿奇霉素半抗原稀释液；称取载体蛋白BSA或OVA30mg溶解在3mLPBS中，将活化阿奇霉素半抗原稀释液逐滴缓慢滴加到载体蛋白溶液中，室温搅拌反应8h，用0.01mol/L的PBS透析，截留分子质量8000～14000u，4℃透析3d，每天换3次透析液，制备完成后分装保存于-20℃。2.3、阿奇霉素单克隆抗体制备2.3.1动物免疫挑选6-8周龄的纯种Balb/c小鼠，用含有弗氏完全佐剂的阿奇霉素半抗原-BSA偶联物进行皮下多点注射，免疫剂量为200μg/只，第三周加弗氏不完全佐剂，免疫一次，第六周免疫一次，第八周加强免，免疫剂量同第一次，三天后取脾融合。2.3.2骨髓瘤细胞和脾细胞的制备SP2/0骨髓瘤细胞采用RPMI-1640培养液培养，取对数生产的骨髓瘤细胞离心，取1×107细胞备用；取经加强免三天后小鼠脾脏，研碎，过细胞筛，取1×108脾细胞悬液。过200目的不锈钢纱布过滤制成脾细胞悬液，计数后备用。2.3.3细胞融合和单克隆化将骨髓瘤细胞和脾细胞按1:10的比例混合，在PEG4000作用下进行融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行单克隆化，直到得到稳定分泌阿奇霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2.3.4细胞冻存和复苏将阿奇霉素单克隆杂交瘤细胞株成1×107个/mL的细胞悬液，液氮中保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，转入锥形瓶中，加入15mL完全培养液中，使用CO2培养箱进行培养。2.3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，包括96孔酶标板、酶标记抗体、阿奇霉素标准品、20×浓缩洗涤液、复溶液工作液、底物A液、底物B液、终止液，所述96孔酶标板上包被有阿奇霉素半抗原-载体蛋白，所述酶标记物浓缩液为辣根过氧化物酶标记的阿奇霉素特异性抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，包括96孔酶标板、酶标记抗体、阿奇霉素标准品、20×浓缩洗涤液、复溶液工作液、底物A液、底物B液、终止液，所述96孔酶标板上包被有阿奇霉素半抗原-载体蛋白，所述酶标记物浓缩液为辣根过氧化物酶标记的阿奇霉素特异性抗体。


2.如权利要求1所述的阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：阿奇霉素半抗原结构式为，



由以下步骤得到：
1)称取阿奇霉素1.0g，用20mL丙酮与20mL吡啶溶解，搅拌均匀；
2)称取马来酸酐0.5g加入步骤1)溶液，80℃条件下搅拌，反应6h后停止，蒸干后上硅胶柱，洗脱液为石油醚:乙酸乙酯＝1:1，分离纯化，得阿奇霉素半抗原。


3.如权利要求1或2所述的阿奇霉素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述阿奇霉素标准品浓度分别为0μg/L，0.02μg/L，0.06μg/L，0.18...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨昌松，王世恩，郝士元，
申请(专利权)人：北京元恩生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11