一种用于生物技术药物N末端半胱氨酸序列分析的快速烷基化方法技术

本发明专利技术公开了一种用于生物技术药物N末端半胱氨酸序列分析的快速烷基化方法，样品直接在PVDF膜上一步完成烷基化修饰，省去换液、脱盐、冻干等步骤，所用试剂更为经济，环保，大大节省前处理时间。

【技术实现步骤摘要】
一种用于生物技术药物N末端半胱氨酸序列分析的快速烷基化方法
本专利技术属于药物分析领域，具体涉及一种用于生物技术药物N术端半胱氨酸序列分析的快速烷基化方法。
技术介绍
生物技术药物的N末端氨基酸序列分析是中国药典明确规定的内容，要求测定N端15个氨基酸。采用氨基酸序列分析仪测定蛋白质药物的N术端氨基酸基于Edman降解原理，从蛋白质的自由N端起，经过衍生、切割、转化等化学反应步骤，生成PTH-氨基酸。PTH-氨基酸在紫外光269nm处有最大吸收，经高效液相分离分析和保留时间最终确认氨基酸的排列顺序。在2015版中国药典三部收录的治疗类生物制品中2种促红素相关产品、3种干扰素α1b相关产品、4种干扰素α2a相关产品、11种干扰素α2b相关产品、4种表皮生长因子相关产品的N末端15个氨基酸序列分析包含了半胱氨酸的测定，另外还有大量药典未收录的生物技术药物N末端需测定半胱氨酸，如胰岛素以及类胰岛素相关产品。半胱氨酸在蛋白质中一般以二硫键形式存在，必须要将二硫键打开，并且进行烷基化修饰才有可能在氨基酸序列分析色谱图上检测到半胱氨酸。在蛋白质序列分析仪生产厂家美国ABI公司提供的UserBulletin上，描述了半胱氨酸的烷基化步骤，包括：1)将干粉状样品(需脱盐处理)溶解于50μL反应液(包含6M盐酸胍、0.25MTris-HCl、2mMEDTA、调pH值为7.5)；2)加入2μL新鲜制备的10％β-巯基乙醇；3)充氩气保护，混匀，在室温避光放置10分钟；4)加入2μL4-乙烯基吡啶-乙醇溶液(1∶6，新鲜制备)；5)充氩气保护，混匀，在室温避光放置10分钟；6)用RP-HPLC小柱进行脱盐处理；7)吸取10μL样品点在甲醇浸润过的PVDF膜上，风干或氩气吹干，洗涤数次，待完全干燥后上样分析一般来说，蛋白质样品都是保存在含盐的缓冲液中，因此利用上述样品处理方法包含了两次脱盐处理和冻干步骤；需使用较昂贵的脱盐小柱；一次二硫键还原步骤，需使用到了具强烈恶臭味道和较强毒性的β-巯基乙醇，再加上烷基化步骤和避光放置时间，整个样品前处理过程耗时在数小时以上。我们针对上述弱点对方法进行了改进，具体如下：
技术实现思路
本专利技术针对生物技术药物N末端半胱氨酸序列测定，采用改进的半胱氨酸烷基化方法，在满足半胱氨酸正确测定的同时达到快速，低成本和环保的目的。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案包括以下步骤：1)吸取10μL样品点在甲醇浸润过的PVDF膜上，风干或氩气吹干，洗涤数次；2)反应缓冲液配制：0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.4)含6M盐酸胍、0.02MDTT、0.2％4-乙烯基吡啶；3)将PVDF膜放入100μL上述反应液中，室温避光放置10分钟；4)取出PVDF膜，去离子水洗涤数次，风干后上样。本专利技术的优点及有益效果为：1)本专利技术采用的烷基化方法直接在PVDF膜上完成反应，避免了换液，脱盐，冻干等步骤，更节省时间。2)本专利技术不使用脱盐RP-HPLC小柱，更为经济环保。3)本专利技术采用一步法完成烷基化反应，相比原法更为快捷。4)本专利技术弃用β-巯基乙醇，改用刺激性气味和毒性相对较弱的DTT，更为环保安全。5)本专利技术采用的方法在一管100μL反应缓冲液中，可同时进行多个不同点膜样品的烷基化反应，相互不影响，同一时间完成，极大的节约了时间，提高了效率。6)本专利技术配制的反应缓冲液可进行回收后重复使用，不影响分析结果。7)本专利技术提出的烷基化方法完成全部样品前处理耗时约15分钟，相比原法数小时，更节省时间。附图说明：图1-120种PTH-氨基酸序列标准图谱图1-2重组人干扰素α2b注射液第一轮Edman降解后产生的PTH-氨基酸图2-1未经过烷基化修饰的重组人促红素注射液N-端第7个氨基酸残基的序列分析色谱图图2-2经过烷基化修饰后的重组人促红素注射液N-端第7个氨基酸残基的序列分析色谱图具体实施方式实施例1重组人干扰素α2b注射液的N-末端氨基酸序列测定：中国药典2015年版第308页3.1.14项内容：重组人干扰素α2b注射液的N-端氨基酸序列为(Met)-Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-Leu，N-端第一个氨基酸为Cys(注：Met可以有也可无，这是重组蛋白的普遍现象)，必须进行烷基化修饰，才能测定。上述样品经本专利技术提供的烷基化方法修饰以后，经蛋白序列分析仪测定，N-端第一个氨基酸残基分析结果见图1。图1-1为20种PTH-氨基酸序列标准图谱，每一种PTH-氨基酸的保留时间作为序列分析的定性依据，图1-2为经过第一轮Edman降解后产生的PTH-氨基酸，也就是该蛋白质的N-端第一个氨基酸残基，经保留时间比对判定为C(Cys)。部分蛋白第一个氨基酸残基为M(Met).如果该蛋白未经烷基化处理，图1-2不会有Cys的色谱峰，仅显示Met的色谱峰。实施例2重组人促红素注射液(CHO细胞)的N-末端氨基酸序列测定：中国药典2015年版第289页3.1.14项内容：重组人促红素注射液(CHO细胞)的N-端氨基酸序列为Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr，N-端第7个氨基酸为Cys，必须进行烷基化修饰，才能测定。样品经本专利技术提供的烷基化方法修饰以后，经蛋白序列分析仪测定，N-端第7个氨基酸残基分析结果见图2，图2-1为未经过烷基化修饰的促红素N-端第7个氨基酸残基的序列分析色谱图，作为对照，可以发现在在保留时间12min没有C(Cys)，而图2-2在经过烷基化修饰后，能清楚地看到C(Cys)的色谱峰。上述实施例只为说明本专利技术的技术构思和特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本专利技术的内容并据以实施，并不能依此限制本专利技术的保护范围。凡根据本专利技术精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生物技术药物N末端半胱氨酸序列分析的快速烷基化方法，其特征在于全部前处理只需约15分钟，更加方便、快捷、安全、环保，包括以下步骤：/n1)吸取10μL样品点在甲醇浸润过的PVDF膜上，风干或氩气吹干，洗涤数次；/n2)反应缓冲液配制：0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.4)含6M盐酸胍、0.02M DTT、0.2％4-乙烯基吡啶；/n3)将PVDF膜放入100μL上述反应液中，室温避光放置10分钟；/n4)取出PVDF膜，去离子水洗涤数次，风干后上样。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于生物技术药物N末端半胱氨酸序列分析的快速烷基化方法，其特征在于全部前处理只需约15分钟，更加方便、快捷、安全、环保，包括以下步骤：
1)吸取10μL样品点在甲醇浸润过的PVDF膜上，风干或氩气吹干，洗涤数次；
2)反应缓冲液配制：0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.4)含6M盐酸胍、0.02MDTT、0.2％4-乙烯基吡啶；
3)将PVDF膜放入100μL上述反应液中，室温避光放置10分钟；
4)取出PVDF膜，去离子水洗涤数次，风干后上样。


2.根据权利要求1所述的用于生物技术药物N末端半胱氨酸序列分析的快速烷基化方法，其特征在于：步骤1)直接在PVDF膜上完成反应，避免了换液，脱盐，冻干等...

【专利技术属性】
技术研发人员：方均建，董方霆，吴胜明，李惠，王德刚，赵俊清，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11