一种包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的制备方法及其应用。按重量份数比，将海藻酸盐和谷物粉混溶于无菌水，高温灭菌，冷却后加入乳清粉，再将上述混合溶液与等体积阴沟肠杆菌Y16菌液混匀，然后滴入钙盐溶液至形成胶粒状固体小球，真空冷冻干燥，得到颗粒状包裹型固体菌剂。所述固体菌剂可以阴沟肠杆菌Y16对进行物理和化学保护作用，提高其在土壤的存活能力，可以提高植物对土壤重金属的修复效果，具有较大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的制备方法及其应用
本专利技术涉及功能微生物菌剂
，更具体地，涉及一种包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的制备方法及其应用。
技术介绍
镉属于高毒性金属，人类活动导致了镉从多途径(采矿、施肥和污水灌溉等)迁移到农田，影响土壤环境质量和农产品安全，其中中国南方地区农田土壤的镉含量相对偏高。农田土壤中镉含量的增加造成种植在这些土壤的农作物面临镉超标的风险，如水稻和小麦的镉超标。根际促生菌是一种生存在植物根系土壤的友好型细菌，它能分泌ACC脱氨酶、吲哚乙酸和细胞分裂素等物质，促进植物生长，降低植物非生物胁迫(盐胁迫、重金属胁迫和养分胁迫等)和提高植物抗病能力。此外，根际促生菌分泌的低分子有机酸和表面活性剂不仅能活化土壤中的难溶态镁、钾、钙等矿质营养元素，提高根际土壤的养分，还能通过酸化、沉淀、络合和氧化还原反应的作用改变重金属在土壤的生物有效性。因此，根际促生菌在重金属污染土壤修复领域具有前景。产铁载体菌(SPB)作为一种常见的根际促生菌，在强化重金属超富集植物提取土壤重金属污染应用中有很强的潜力。例如：专利CN110616164A公开了一株可活化难溶性磷、镉的产铁载体菌-阴沟肠杆菌(Enterobactecloacae)Y16，该产铁载体菌能提高土壤铁元素的生物有效性，帮助在缺铁土壤生长的植物获取铁营养，促进植物生长，并通过分泌表面活性剂，活化土壤中的难溶态重金属镉，提高土壤重金属镉的生物有效态，有助于超富集植物对土壤重金属镉的吸收和转运。但是，产铁载体菌在土壤环境易中受到微生物间生态位的竞争压力和外部干燥的环境等压力胁迫下往往存活能力极低，这会严重影响到产铁载体菌参与的植物重金属修复过程。因此，研发合适的菌剂载体提供适应的生态位，并对产铁载体菌进行物理和化学保护作用，提高产铁载体菌在土壤的存活能力极为重要。目前，多用生物炭做为细菌的吸附载体制备成固体菌剂，但是由于生物炭对土壤重金属具有极强的物理化学吸附特性，阻碍了植物对土壤中重金属的提取过程，因此并不适用于植物重金属修复过程，因此研制出适用于植物重金属修复的固体菌剂，提高植物对土壤重金属的提取效率具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的制备方法。本专利技术的第二个目的在于提供由上述制备方法制备得到的包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂。本专利技术的第三个的目的在于提供所述包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的应用。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的制备方法，按重量份数比，将海藻酸盐和谷物粉混溶于无菌水，高温灭菌，冷却后加入乳清粉，再将上述混合溶液与等体积阴沟肠杆菌Y16菌液混匀，然后滴入钙盐溶液至形成胶粒状固体小球，真空冷冻干燥，得到颗粒状包裹型固体菌剂；所述海藻酸盐、谷物粉、无菌水和乳清粉的重量份数比为2～5：5～10：80～100：1～3。由于固体菌剂其组成成分须对土壤环境和微生物无害，因此本专利技术固体菌剂采用的海藻酸盐是一种天然的阴离子聚合物，通常从褐藻中提取，与二价钙离子结合形成低毒性的温和凝胶，对促生菌具有包裹保护作用。谷物粉不仅能为促生菌提供碳源，还能增加土壤有机质，促进植物生长；乳清粉可有效降低后续冷冻干燥过程中形成的冰晶对促生菌的损害，提高促生菌的在固体菌剂的再水合化的复苏能力，具有延长菌剂的保存时间，提高促生菌的存活能力的作用。制备得到的固体菌剂可以阴沟肠杆菌Y16对进行物理和化学保护作用，提高其在土壤的存活能力，提高植物对土壤重金属的修复效果。优选地，所述海藻酸盐为海藻酸钠。优选地，所述谷物粉为黑麦粉。优选地，所述阴沟肠杆菌Y16菌液浓度为107～108CFU/mL。进一步优选地，所述阴沟肠杆菌Y16菌液浓度为108CFU/mL。优选地，所述钙盐为氯化钙。优选地，所述钙盐溶液浓度为0.1mol/L～0.3mol/L。进一步优选地，所述钙盐溶液浓度为0.1mol/L。优选地，所述海藻酸盐、谷物粉、无菌水和乳清粉的重量份数比为2：7.5：100：2。优选地，所述真空冷冻干燥为-45～-55℃下真空冷冻干燥2～3d。进一步优选地，所述真空冷冻干燥为-50℃下真空冷冻干燥2d本专利技术还提供上述任一所述的制备方法制备得到的包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂。优选地，所述包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂粒径约为2毫米。本专利技术还提供上述包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂在强化植物重金属修复效果中的应用。优选地，所述植物为龙葵。优选地，所述重金属为镉。优选地，所述土壤为农田土壤。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过将阴沟肠杆菌Y16与一定比例的海藻酸盐，谷物粉，乳清粉混匀，滴入钙盐溶液至形成胶粒状固体小球，冷冻干燥后制备成包裹型固体菌剂。所述固体菌剂可以阴沟肠杆菌Y16对进行物理和化学保护作用，提高其在土壤的存活能力，可以提高植物对土壤重金属的修复效果，具有较大的应用前景。附图说明图1为两种固体菌剂的外观。图2为添加剂对菌剂释菌能力的影响。图3为添加剂对菌剂保存时间的影响。图4为龙葵各处理组生物量。图5为龙葵各处理组镉积累量。图6为龙葵各处理组镉富集系数。图7为包裹型菌剂的SEM扫描电镜。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。供试菌株：阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)Y16，简称EC菌株，所述菌株于2018年12月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCCNo：60524。实施例1不同类型菌剂的制备将EC菌从斜面培养基接种到LB液体培养基中，在28℃，150r/min摇床条件培养14-18h，4000r/min离心10min收集菌体，用无菌水等体积重悬备用(菌液浓度为108CFU/mL)。粉末型菌剂制备：称取70g的黑麦粉末与20g的硅藻土，均匀混合，高温灭菌，冷却后将固体粉末与EC菌液按1：1的比例搅拌混合，在28℃，150r/min摇床条件培养3d，然后加入5g的麦芽糖粉和5g的乳清粉均匀混合，-50℃下进行真空冷冻干燥2d。包裹型菌剂制备：称取将2g的海藻酸钠和7.5g的黑麦粉放置于100mL无菌水溶剂搅拌混合，高温灭菌，冷却后加入2g的乳清粉，将黏稠的溶液与EC菌液按1：1的比例搅拌混合，利用滴管吸取溶液，缓慢滴入0.1mol/L的氯化钙溶液，形成胶粒状固体小球，-50℃下进行真空冷冻干燥2d。如图1所示，由海藻酸钠和黑麦粉为主体制备成的称为包裹型菌剂，由黑麦粉和硅藻土本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的制备方法，其特征在于，按重量份数比，将海藻酸盐和谷物粉混溶于无菌水，高温灭菌，冷却后加入乳清粉，再将上述混合溶液与等体积阴沟肠杆菌Y16菌液混匀，然后滴入钙盐溶液至形成胶粒状固体小球，真空冷冻干燥，得到颗粒状包裹型固体菌剂；所述海藻酸盐、谷物粉、无菌水和乳清粉的重量份数比为2～5：5～10：80～100：1～3。/n

【技术特征摘要】
1.一种包裹型阴沟肠杆菌Y16固体菌剂的制备方法，其特征在于，按重量份数比，将海藻酸盐和谷物粉混溶于无菌水，高温灭菌，冷却后加入乳清粉，再将上述混合溶液与等体积阴沟肠杆菌Y16菌液混匀，然后滴入钙盐溶液至形成胶粒状固体小球，真空冷冻干燥，得到颗粒状包裹型固体菌剂；所述海藻酸盐、谷物粉、无菌水和乳清粉的重量份数比为2～5：5～10：80～100：1～3。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述海藻酸盐为海藻酸钠。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述谷物粉为黑麦粉。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述阴沟肠杆菌Y16菌液浓度为107～108CFU/mL。

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【专利技术属性】
技术研发人员：王立立，唐万鹏，王东升，李取生，何宝燕，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44