本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE‑311‑faeG菌株及其应用和制备方法，该菌株能表达双黏附素，其细胞壁具有很强的与肠道细胞受体结合的能力，可以对多重致病性大肠杆菌的侵袭提供更多的占位保护能力，有效保护肠道健康，能应用于制备为保护肠道的药物。
【技术实现步骤摘要】
大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG及应用
本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG菌株及其应用和制备方法。
技术介绍
肠毒素性大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是引起新生仔猪和断奶仔猪黄痢、白痢、水肿等腹泻疾病的主要病原菌之一，给我国乃至全世界养猪业带来了巨大经济损失。ETEC的主要致病因子有两种：黏附素(又称定居因子抗原)和肠毒素。在感染初生仔畜后，ETEC通过黏附素在宿主肠道内迅速定植、繁殖，进而产生肠毒素使动物水和电解质失衡，出现腹泻甚至脱水死亡的情况，发病率和死亡率均很高。定植过程是毒素积累的前提条件，ETEC的致病性很大程度上取决于其定植、增殖的能力。不同的ETEC菌株的菌毛抗原类型不同，主要有K88、K99、F41、987P，引起仔猪腹泻的主要肠毒性大肠杆菌菌株的抗原类型主要是K88和K99。近年来，为了解决由ETEC引起的仔猪腹泻等一系列疾病，国内外学者致力于具有抗体菌株的疫苗研发工作。传统的多黏附素菌株的构建都是扩增多重菌毛基因串联表达，且以常见工程菌作为宿主，常见工程菌自身都不具备K99黏附素基因片段也不能表达K99黏附素，而本专利技术提供了筛选出的一种具有高转化效率的菌株作为改造、表达宿主，且该菌株自身具有K99黏附素并能大量表达外源质粒的基因。本专利技术利用筛选出的菌株所制备重组菌株能够实现肠毒性大肠杆菌特异性菌毛的双重表达，使重组菌株能够同时具备多重黏附蛋白抗原，为多联黏附蛋白抗体提供菌株基础。同时，表达有双黏附素的大肠杆菌细胞壁具有更强的与肠道细胞受体结合的能力，可以对多重致病性大肠杆菌的侵袭提供更多的占位保护能力，重组菌株本身黏附能力的有效加强使其在与有害菌竞争肠道定植位点时处于优势地位，能有效保障动物体内肠道健康。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术以绿色荧光蛋白GFP作为报告基因，转化至不同肠毒素性大肠杆菌中，筛选出一株具有高转化效率的菌株作为改造、表达宿主。本专利技术提供了一种大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG菌株，其16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。以及，所述的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG菌株保护肠道的应用。以及，所述的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG菌株制备为保护肠道的药物中的应用。以及，所述的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG菌株具有K99黏附素和K88黏附素的应用。所述的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG菌株，其制备方法为：步骤1.大肠杆菌表面展示表达载体的构建：选取Lpp前29个氨基酸序列设计引物并进行生物合成；根据OmpA的基因序列设计引物，并以肠杆菌DH5α基因组DNA为模板进行扩增，将两段基因通过重叠延伸PCR的方式进行融合表达，构成pQE30-Lpp’OmpA质粒；选择K88菌毛的主要蛋白亚基faeG为目的基因进行黏附素的扩增，并与pQE30-Lpp’OmpA质粒进行连接，完成pQE30-Lpp’OmpA-faeG重组表达载体的构建。步骤2.大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311的外源黏附素表达：用CaCl2法将大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311制备成大肠杆菌感受态；将步骤1中构建好的pQE30-Lpp’OmpA-faeG质粒转化至感受态中，培养得到大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG。本专利技术提供EscherichiacoliETECBE-311-faeG菌株能表达K99黏附素和K88黏附素，表达有双黏附素的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG细胞壁具有很强的与肠道细胞受体结合的能力，可以对多重致病性大肠杆菌的侵袭提供更多的占位保护能力，有效保护肠道健康。同时相比传统菌株重组构建、表达菌毛蛋白、提纯蛋白的繁琐步骤而言，本重组菌株EscherichiacoliETECBE-311-faeG无需经过提纯蛋白的过程，直接将外源黏附素展示在菌株表面，利用辐照致死后就可以使用。附图说明图1为ETECBE-311的肠毒素类型检测电泳图；图2为ETECBE-311的黏附素类型检测电泳图；图3为双砷-四半胱氨酸系统特异性检测的荧光显微镜检测结果；图4为IPEC-J2细胞黏附实验的显微镜观察结果；图5为ETECBE-311-faeG在大鼠胃肠道中阻碍ETEC定植的作用探究的动物实验设计方案示意图。具体实施方式本专利技术提供如下技术方案：本专利技术从湖北省武汉市江夏区某养猪场腹泻仔猪粪便样品中分离、纯培养，经过革兰氏染色鉴定、16SrRNA扩增比对、肠毒素基因扩增后，得到大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年9月18日，保藏编号为：CCTCCNO：M2019733，分类学命名Escherichiacoli。大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311的肠毒素、黏附素基因检测：根据NCBI上已发表的序列信息，设计如表1菌株筛选鉴定所用引物表中所示的特异性引物，对分离得到的大肠杆菌进行肠毒素(LTa、LTb、ST1、ST2)和黏附素(K88、K99、987P、F41)基因检测，PCR反应体系及程序参照16SrRNA扩增步骤。图1为ETECBE-311的肠毒素类型检测电泳图，其中M：DL2000bpDNAMarker；泳道1：ST1；泳道2：ST1阳性对照；泳道3：ST2；泳道4：ST2阳性对照；泳道5：LTb；泳道6：LTb阳性对照；泳道7：LTa；泳道8：LTa阳性对照。图2为ETECBE-311的黏附素类型检测电泳图，M：DL2000bpDNAMarker；泳道1：BE-311菌毛类型检测；泳道2：标准菌株菌毛阳性对照。从图2中能看出ETECBE-311自身具有类型为K99的黏附素。表1：菌株筛选鉴定所用引物表利用上述筛选出的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311菌株，本专利技术对其进行质粒重组，提供了重组菌株大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG的制备方法及其应用。该方法转入了外源质粒但并未改变菌株本，所以重组菌株大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG与大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311的16SrDNA序列一致，如SEQIDNO.1所示。所述重组菌株大肠杆菌EscherichiacoliETEC本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311-faeG菌株，其16SrDNA序列如SEQ IDNO.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG菌株，其16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG菌株保护肠道的应用。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG菌株制备为保护肠道的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG菌株具有K99黏附素和K88黏附素的应用。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311-faeG菌株，其特征在于制备方法为：
步骤1.大肠杆菌表面展...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭小华，胡佳，张莉，卢霜，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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