用于跟踪和操纵细胞RNA的融合蛋白和融合核糖核酸制造技术

本文描述了组合物、系统、方法和试剂盒，其利用RNA结合蛋白融合物，如含有向导核苷酸序列可编程RNA结合蛋白的CRISPR‑Cas蛋白融合物，和翻译调节蛋白。同时，本文还描述了组合物、系统、方法和试剂盒，其利用CRISPR‑Cas相关RNA融合物，其包含向导核苷酸序列可编程RNA和内部核糖体进入位点(IRES)。本文所述的组合物、系统、方法和试剂盒可用于上调或下调mRNA翻译。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于跟踪和操纵细胞RNA的融合蛋白和融合核糖核酸相关申请的交叉引用本申请要求2018年4月20日提交的美国临时申请序列号62/660,849和2018年5月2日提交的美国临时申请序列号62/665,860的优先权，这两个申请通过引用全文纳入本文。政府支持声明本专利技术是在政府支持下由国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的基金号NS103172资助完成。美国政府享有本专利技术的一定权利。
技术介绍
当前没有统一的系统可以既上调又下调特定信使RNA(mRNA)靶标的翻译。实现靶向下调的已知方法包括反义寡核苷酸(ASO)和短干扰RNA(siRNA)。但是，这两种技术的作用都是使信使RNA靶标不稳定并下调翻译，而不是上调翻译。几乎没有增加mRNA翻译的已知方法，并且这些方法还没有充分表征。因此，需要提供用于招募反式的翻译起始前复合物并由此在细胞和基因治疗技术中控制翻译的组合物和方法。
技术实现思路
本公开涉及使用CRISPR-Cas蛋白融合物控制细胞中mRNA翻译的组合物，系统，方法和试剂盒。这些组合物，方法，系统和试剂盒利用了CRISPR-Cas系统的RNA靶向能力，该系统使用向导RNA来提供一个简单且可快速编程的系统，用于识别细胞中的RNA分子。这些组合物，方法，系统和试剂盒进一步利用CRISPR-Cas系统结合靶信使RNA的能力，通过将募集翻译起始前复合物的核糖核酸序列融合到单链向导RNA上从而融合到结合的信使RNA来启动反式翻译。CRISPR-Cas系统还对信使RNA的稳定性产生中性影响，这使得蛋白质表达的任何测量变化都成为融合蛋白质效应物的变量。当与用于控制mRNA表达的其他组合物，方法，系统和试剂盒相比时，本文所述的组合物，系统，方法和试剂盒提供了高实用性和多功能性。一方面，组合物包含一种或多种编码以下物质的多核苷酸：(i)向导核苷酸序列-可编程RNA结合蛋白；和(ii)翻译修饰蛋白。在一些实施方式中，所述向导核苷酸序列可编程RNA结合蛋白包含以下的至少一种：Cas9，修饰的Cas9，Cas13a，Cas13b，CasRX/Cas13d，CasM及其各自的生物等同物。在一些实施方式中，向导核苷酸序列可编程RNA结合蛋白包含以下的至少一种：化脓性链球菌(Steptococcuspyogenes)Cas9(spCas9)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)Cas9(saCas9)，新凶手弗朗西丝氏菌(Francisellanovicida)Cas9(FnCas9)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)Cas9(nmCas9)，嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)1Cas9(St1Cas9)，嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)3Cas9(St3Cas9)和侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)Cas9(BlatCas9)。在一些实施方式中，向导核苷酸序列-可编程RNA结合蛋白是核酸酶失活的。在一些实施方式中，翻译修饰蛋白是以下的至少一种：真核翻译起始因子4E(EIF4E)(SEQIDNO：52-59)，真核翻译起始因子4E结合蛋白(EIF4E-BP1)(SEQIDNO：61-62)，泛素相关蛋白2-样(UBAP2L)(SEQIDNO：64-71)及其各自的生物等同物。在一些实施方式中，翻译修饰蛋白由具有以下序列的多核苷酸编码，该序列包含以下的至少一种的全部或部分：SEQIDNO：52-55，SEQIDNO：61，SEQIDNO：64-67，SEQIDNO：94-193，SEQIDNO：285及其各自的生物等同物。在一些实施方式中，其中所述翻译修饰蛋白具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含以下的至少一种的全部或部分：SEQIDNO：56-59，SEQIDNO：62，SEQIDNO：68-71及其各自的生物等同物。在一些实施方式中，所述组合物还包含接头。在一些实施方式中，接头是肽接头。在一些实施方式中，肽接头包含三肽GGS的一个或多个重复。在一些实施方式中，接头是非肽接头。在一些实施方式中，非肽接头包括聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇(PPG)，共聚(乙二醇/丙二醇)，聚氧乙烯(POE)，聚氨酯，聚磷腈，多糖，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯基吡咯烷酮，聚乙烯基乙醚，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸酯，聚氰基丙烯酸酯，脂质聚合物，几丁质，透明质酸，肝素或烷基接头。在一些实施方式中，向导核苷酸序列-可编程RNA结合蛋白与向导RNA(gRNA)，crispRNA(crRNA)或反式激活crRNA(tracrRNA)结合。在一些实施方式中，翻译修饰蛋白的一个或多个激酶磷酸化结构域被突变。在一些实施方式中，组合物还包含载体。在一些实施方式中，载体是腺病毒载体，腺相关病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方式中，载体还包含表达控制元件。在一些实施方式中，载体还包含可选择标志物。在一些实施方式中，载体还包含编码(i)gRNA或(ii)crRNA和tracrRNA的多核苷酸。在一些实施方式中，gRNA或crRNA包含与靶RNA2补的核苷酸序列。在一个方面，一种融合蛋白，其包含：(i)向导核苷酸序列-可编程RNA结合蛋白；和(ii)翻译修饰蛋白。在一些实施方式中，一种用于转录后基因调控的系统，该系统包括：(i)融合蛋白；和(ii)gRNA；或(iii)crRNA和tracrRNA；其中gRNA或crRNA包含与靶mRNA互补的序列。在一些实施方式中，一种用于转录后调节基因表达的方法，所述方法包括使靶mRNA与融合蛋白接触，其中所述向导核苷酸序列-可编程RNA结合蛋白能结合与靶RNA的区域杂交的gRNA或crRNA。在一个方面，一种融合RNA，其包含：(i)向导核苷酸序列-可编程RNA；和(ii)一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方式中，所述向导核苷酸序列-可编程RNA是向导RNA(gRNA)或crisprRNA(crRNA)。在一些实施方式中，所述向导核苷酸序列-可编程RNA衍生自来自化脓性链球菌，金黄色葡萄球菌，新凶手弗朗西丝氏菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，嗜热链球菌或侧孢短芽孢杆菌的向导RNA支架。在一些实施方式中，IRES是以下的至少一种：脊髓灰质炎IRES，鼻病毒IRES，脑心肌炎病毒IRES(EMCV-IRES)，小核糖核酸病毒IRES，口蹄疫病毒IRES(FMDV-IRES)，口咽病毒IRES，卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒IRES(KSHV-IRES)，甲型肝炎IRES，丙型肝炎IRES，经典猪瘟病毒IRES，瘟病毒IRES，牛病毒性腹泻病毒IRES，弗云德(Friend)鼠白血病IRES，莫洛尼鼠白血病IRES(MMLV-IRES)，劳斯肉瘤病毒IRES，人类免疫缺陷病毒IRES(HIV-IRES)，小珀椿象肠病毒IRES，双顺反子病毒(Cripavirus)IRES，蟋蟀麻痹病毒IRES，锥蝽病毒IRES，禾谷缢管蚜病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，其包含编码以下物质的一种或多种多核苷酸：/n(i)向导核苷酸序列可编程RNA结合蛋白；和/n(ii)翻译修饰蛋白。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180420 US 62/660,849;20180502 US 62/665,8601.一种组合物，其包含编码以下物质的一种或多种多核苷酸：
(i)向导核苷酸序列可编程RNA结合蛋白；和
(ii)翻译修饰蛋白。


2.如权利要求1所述的组合物，其中所述向导核苷酸序列可编程RNA结合蛋白包含Cas9，修饰的Cas9，Cas13a，Cas13b，CasRX/Cas13d，CasM及其各自的生物学等同物中的至少一种。


3.如权利要求2所述的组合物，其中所述向导核苷酸序列可编程RNA结合蛋白包含以下的至少一种：化脓性链球菌(Steptococcuspyogenes)Cas9(spCas9)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)Cas9(saCas9)，新弗朗西斯菌(Francisellanovicida)Cas9(FnCas9)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)Cas9(nmCas9)，嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)1Cas9(St1Cas9)，嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)3Cas9(St3Cas9)和侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)Cas9(B1atCas9)。


4.如权利要求2或3所述的组合物，其中所述向导核苷酸序列可编程RNA结合蛋白是核酸酶失活的。


5.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述翻译修饰蛋白是以下的至少一种：真核翻译起始因子4E(EIF4E)(SEQIDNO：52-59)，真核翻译起始因子4E结合蛋白(EIF4E-BP1)(SEQIDNO：61-62)，泛素相关蛋白2-样(UBAP2L)(SEQIDNO：64-71)及其各自的生物学等同物。


6.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述翻译修饰蛋白由具有包含SEQIDNO：52-55，SEQIDNO：61，SEQIDNO：64-67，SEQIDNO：94-193，SEQIDNO：285，SEQIDNO：320-348及其各自的生物学等同物中至少一种的全部或部分的序列的多核苷酸编码。


7.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述翻译修饰蛋白具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含以下的至少一种的全部或部分：SEQIDNO：56-59，SEQIDNO：62，SEQIDNO：68-71及其各自的生物学等同物。


8.如前述权利要求中任一项所述的组合物，还包含接头。


9.如权利要求8所述的组合物，其中所述接头是肽接头。


10.如权利要求9所述的组合物，其中所述肽接头包含三肽GGS的一个或多个重复。


11.如权利要求8所述的组合物，其中所述接头是非肽接头。


12.如权利要求11所述的组合物，其中所述非肽接头包括聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇(PPG)，共聚(乙二醇/丙二醇)，聚氧乙烯(POE)，聚氨酯，聚磷腈，多糖，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯基吡咯烷酮，聚乙烯基乙醚，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸酯，聚氰基丙烯酸酯，脂质聚合物，几丁质，透明质酸，肝素或烷基接头。


13.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述向导核苷酸序列可编程RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·叶，F·谭，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US