一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的生物样品中CB定量的新方法技术

本发明专利技术公开了一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的生物样品中炭黑定量的方法。该方法包括下述步骤：1)配制含不同浓度炭黑的BSA溶液，分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用UMAX Magic扫描仪对每条炭黑‑BSA复合物对应的电泳条带进行图像扫描，利用Gel‑pro图像软件测量所述电泳条带的光密度(IOD)，建立IOD与炭黑浓度的标准曲线；2)将待测生物样品进行前处理，再将处理后的生物样品采用步骤1)中的方法进行测定，得到所对应电泳条带的IOD，代入步骤1)的标准曲线，得到所述待测生物样品炭黑浓度。该方法所需的样品少，费用低廉，但具有很高的可靠性和准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的生物样品中CB定量的新方法
本专利技术属于生物纳米分析
，具体涉及一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的生物样品中CB定量的新方法。
技术介绍
炭黑(CB)具有广泛的工业应用，近年来已被用作空气颗粒物(PM)环境健康研究的基本模型。炭黑在生物中的暴露表征是解析炭黑对人类健康影响的第一步和最重要的一步。然而，由于缺乏能够定量生物样品中CB的有效方法，研究工作在很大程度上受到限制。目前，有几种方法可用于定量生物样品中的纳米粒子，包括电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、显微镜技术、拉曼光谱、热光学透射率(TOT)、和同位素/荧光标记。然而，也有一些缺点限制了它们的应用。例如，在瑞士小鼠体内的CB动力学研究中，用Be同位素标记CB供口服，然后测量同位素的浓度。但是随着时间的推移可能会导致标签脱离。对于ICP-MS分析，由于纳米材料必须被消化成可溶的形态，很难从生物样品中区分碳的来源。TOT也存在同样的问题，而且由于缺少恒温加热程序，检测结果存在差异。拉曼光谱仅用于相对量化单个细胞内的纳米材料。此外，测定它们都需要昂贵的仪器和复杂的预处理。因此，仍然需要一种简单、可靠、无标签的定量方法来测量生物系统中的CB。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的生物样品中CB定量的方法。该方法经济、方便，可在大多数生物实验室进行。CB或CB-蛋白复合物表面的负电荷促使CB在电场中迁移，并在凝胶界面聚集形成条带(如图1.A所示)。定量分析中，通过将条带灰度与负载CB量相关联。这种方法所需的样品少，费用低廉，但具有很高的可靠性和准确性。本专利技术所提供基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的生物样品中CB定量的方法，包括下述步骤：1)配制含不同浓度炭黑(CB)的BSA溶液，分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用UMAXMagic扫描仪对每条炭黑-BSA复合物对应的电泳条带进行图像扫描，利用Gel-pro图像软件(MediaCybernetics,USA)测量所述电泳条带的光密度(IOD)，建立IOD与上样样品中炭黑(CB)质量的标准曲线；2)将待测生物样品进行前处理，再将处理后的生物样品采用步骤1)中的方法进行测定，得所对应电泳条带的光密度(IOD)，代入步骤1)的标准曲线，得到所述待测生物样品炭黑(CB)浓度。上述方法步骤1)中，所述BSA溶液中BSA的浓度为2mg/mL。所述含不同浓度炭黑(CB)的BSA溶液中炭黑(CB)的浓度范围为0-0.125mg/mL。所述步骤1)中的标准曲线可为y＝226.98x-0.8019，R2＝0.9992，其中，y为对应电泳条带的光密度(IOD)，x为上样样品中炭黑的质量(由于上样体积是固定的，所以直接换算成上样样品中炭黑的质量)。上述方法步骤1)中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳可为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)；所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的堆积胶的胶浓度为5％，电泳条件为：电压为120V，时间为2h。所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的每个上样样品包含5.0μLBSA，5.0μLCB标准液，10.0μL2X缓冲液(缓冲液由4％的SDS和10％的2-巯基乙醇组成。)。上述方法步骤1)中所述图像扫描的分辨率为200dpi。上述方法步骤2)中，所述生物样品可为细胞、组织或器官。所述生物样品为来自任意物种的细胞(如Raw264.7、A549细胞或MSCs)，对所述细胞进行前处理的方法为将所述细胞进行裂解，再将裂解液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。所述生物样品为组织或器官，将所述组织或器官匀浆后再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。上述方法步骤2)中，所述处理后的生物样品上样前需要测定其蛋白含量，并调整其蛋白浓度(可用上样缓冲液调节浓度)为步骤1)中所述BSA溶液中的蛋白含量1/2。上述方法步骤2)中，聚丙烯酰胺凝胶电泳的每个上样样品包含聚丙烯酰胺凝胶电泳的每个上样样品包含10.0μL生物样品，10.0μL2X缓冲液(缓冲液由4％的SDS和10％的2-巯基乙醇组成。)。在本专利技术中，专利技术人开发了一种基于SDS-PAGE的方法来定量生物样本中的CB，具有令人满意的可靠性和准确性。炭黑粒子的表面负电荷使其在电场中向阳极迁移，由于凝胶孔径只有2-5nm，这比CB颗粒的尺寸(17±3nm)小得多，所以到达堆积凝胶层后，CB颗粒无法进入分离胶层，从而在凝胶界面聚集，形成明显的条带。拉曼光谱证实样品中所有的CB都在条带内，而没有分散到其他凝胶层中(图1.A)。可在微量样品(1–30μL)中快速、可靠地进行定量。凝胶电场中分子迁移的驱动力是电荷。对于中性电的纳米粒子，SDS包裹层使粒子带负电荷来驱动纳米粒子的迁移。由于zeta电位分析发现BSA包被的和细胞裂解液中的CB均带负电荷(见表1)，因此我们使用不带SDS和巯基乙醇的native-PAGE对样品进行分析。在native-PAGE凝胶中也形成了CB条带。考马斯蓝染色后，native-page凝胶中出现BSA条带，与SDS-PAGE相同(图2)，说明在CNMs带负电荷的情况下，该方法可以进一步简化。综合来看，纳米粒子携带的负电荷足以驱动纳米粒子在电场中的泳动。由于这种方法依赖于条带强度来定量，因此，理论上它适合于定量生物样本(如组织/器官匀浆)中的灰色纳米颗粒。表1.纳米材料在BSA溶液(2mg/mL)和细胞裂解液中的Zeta电位(ZP,mV)。数据代表了三次独立实验的结果，并以平均值±S.D表示与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1)样品制备简单，只需原位裂解细胞，减少实验偏差；2)可以通过BSA溶液直接制备校准曲线，它可广泛适用于各种细胞；3)凝胶扫描，数字化和定量的条带只需要一个UMAXMagic扫描仪，这是一种分子生物学实验常规设备；4)所需的样品少，费用低廉，但具有很高的可靠性和准确性。附图说明图1为样品凝胶电泳后CB的定性定量分析。(A)对凝胶进行拉曼扫描，得到CB的分布。低凝胶图像是电泳后的考马斯蓝染色凝胶，显示CB带和BSA带的存在。(B)通过SDS-PAGE对BSA和细胞裂解基质中一系列浓度的CB标准品进行成像和定量。每个试样包含5.0μLBSA或细胞溶解产物(2mg/mL)，5.0μLCB标准液,10.0μL2X缓冲液(由4％的SDS和10％的2-巯基乙醇组成)，上样到5％的堆积胶，120V电泳2h。扫描图像显示，在凝胶和加样孔的界面聚集了含有CB的物质，呈薄的暗色条带。第1-7列为标准样品(混合0-0.125mg/mLCB)。下面显示了校准曲线，显示了条带的IOD与CB量之间的线性关系。数据代表了三次独立的实验，并表示为平均值±S.D.图2为Native-PAGE和SDS-PAGE凝胶电泳的比较。(A)native-PAGE使用UMAXMagic扫在120V下扫描2小时。(B)用0.5％考本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的生物样品中炭黑定量的方法，包括下述步骤：/n1)配制含不同浓度炭黑的BSA溶液，分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用UMAXMagic扫描仪对每条炭黑-BSA复合物对应的电泳条带进行图像扫描，利用Gel-pro图像软件测量所述电泳条带的光密度，建立IOD与上样样品中炭黑质量的标准曲线；/n2)将待测生物样品进行前处理，再将处理后的生物样品采用步骤1)中的方法进行测定，得到所对应电泳条带的IOD，代入步骤1)的标准曲线，得到所述待测生物样品炭黑浓度。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的生物样品中炭黑定量的方法，包括下述步骤：
1)配制含不同浓度炭黑的BSA溶液，分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用UMAXMagic扫描仪对每条炭黑-BSA复合物对应的电泳条带进行图像扫描，利用Gel-pro图像软件测量所述电泳条带的光密度，建立IOD与上样样品中炭黑质量的标准曲线；
2)将待测生物样品进行前处理，再将处理后的生物样品采用步骤1)中的方法进行测定，得到所对应电泳条带的IOD，代入步骤1)的标准曲线，得到所述待测生物样品炭黑浓度。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述BSA溶液中BSA的浓度为2mg/mL；
所述含不同浓度炭黑的BSA溶液中炭黑的浓度范围为0-0.125mg/mL。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的胶浓度为5％，电泳条件为：电压为120V，时间为2h。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的每个上样样品包含5.0μLBSA...

【专利技术属性】
技术研发人员：万斌，刘科阳，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11