一种利用D-葡萄糖生物合成D-阿洛糖的方法技术

一种利用D‑葡萄糖生物合成D‑阿洛糖的方法属于大肠杆菌代谢工程领域，旨在利用生物体合成D‑阿洛糖，由于D‑阿洛糖在自然界中含量极少，且提取率低，所以在工程大肠杆菌中合成D‑阿洛糖是一个值得研究的内容。在大肠杆菌中引入三个外源基因gi、dpe、rpiB最终将D‑葡萄糖异构合成D‑阿洛糖。为了稳定产量，在途径构建时，敲除了FruA、ptsg、pfkB、glk、mak、pfkA六个基因，并且过表达了Galp，进而在D‑阿洛糖合成时，能够实现多种碳水化合物的共利用，而且使得甘油用于菌种生长，D‑葡萄糖以更高的转化率合成D‑阿洛糖。

【技术实现步骤摘要】
一种利用D-葡萄糖生物合成D-阿洛糖的方法
本专利技术属于大肠杆菌代谢工程领域，具体涉及了合成D-阿洛糖的方法，尤其涉及一种以葡萄糖和甘油联合生产阿洛糖的工程菌及其构建方法和路径。
技术介绍
D-阿洛糖是一种己醛糖，是一种罕见的单糖，为白色无味的结晶固体，是无热量的糖，没有毒性。化学式CH2OH(CHOH)4CHO，分离于一种非洲灌木的叶子，但是提取率极低，所以D-阿洛糖的人工合成变得更为迫切。D-阿洛糖溶于水但几乎不溶于甲醇，D-阿洛糖是葡萄糖的C-3差向异构体。D-阿洛糖主要以环状形式存在，由β-D-allo-1.5-吡喃糖(77.5％)，α-D-allo-1.5-吡喃糖(14％)，β-D-allo-1.4-呋喃糖(5％)和α-D-allo-1.4-呋喃糖(3.5％)组成，其中β-D-allo-1.5-吡喃糖是主要成分。近年来，由于D-阿洛糖具有许多药物活性而引起了广泛关注，D-阿洛糖抑制癌变，特别是在氧化应激条件下，可以抑制多种癌细胞系的增殖，包括宫颈癌、肝细胞癌、卵巢、头颈部、皮肤和前列腺癌。并且在癌症治疗中D-阿洛糖和放射的组合提高了肿瘤的治愈率。D-阿洛糖还可以作为一种抗氧化剂，在作为药物制剂中的治疗剂和配方食品中的功能性成分有一定的潜力。D-阿洛糖作为一种抗炎剂，可抑制缺血-再灌注损伤，抑制节段性中性粒细胞生成，并降低血小板计数。D-阿洛糖与低剂量FK506联合使用显著增加了同种异体移植物的存活率，同时减少了组织损伤。此外，右旋糖酐对细胞有冷冻保护作用。因此，D-阿洛糖在外科手术和移植中有一定的应用前景。然而，D-阿洛糖的来源主要来源于化学合成和生物合成，由于化学合成有很多弊端，比如合成路径复杂，副产物多，环境污染大，分离纯化难度高，所以在合成阿洛糖时，生物合成更具竞争力，而微生物发酵来生产阿洛糖，成本低且环保。但是当使用D-葡萄糖作为唯一碳源时，D-阿洛糖在大肠杆菌中的产量比较低，因为葡萄糖既要产生细胞生物量又要提供生产D-阿洛糖。先前的报道表明，在敲除磷酸化的特异性通透酶后，可以降低葡萄糖的摄取利用，但是大肠杆菌的生物量会受到影响，所以需要额外的碳源来补齐对细胞生长的亏欠。由于实验途径的原因选择了糖酵解途径下游的三碳物质-甘油来补齐亏欠，而甘油本身结构简单，代谢途径明晰。当葡萄糖与甘油共存作为碳源，野生大肠杆菌优先消耗葡萄糖，实现葡萄糖和甘油共利用，且使菌能够利用葡萄糖高效生产D-阿洛糖仍具有很大挑战性。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提供一种生产D-阿洛糖的工程菌及其构建方法和应用，并利用基因调控，使得细胞代谢平衡，在利用甘油提供生长的同时，D-葡萄糖用于合成D-阿洛糖。为实现上述目的，本专利技术具体技术方案如下：在代谢工程菌株大肠杆菌JM109(DE3)中利用D-葡萄糖合成D-阿洛糖，(如图1)首先要构建主途径所需的三个基因，然后再跟据代谢途径，敲除D-葡萄糖供生长消耗的途径，同时解除葡萄糖效应，实现多糖共利用的局面，使得大多数D-葡萄糖用于合成D-阿洛糖，而甘油的消耗主要是支持细胞生长，同时优化了D-葡萄糖进入细胞的非磷酸化途径。本专利技术提供一种生产D-阿洛糖的工程菌，包括宿主菌和转入宿主菌的质粒载体，其中所述的质粒载体中整合了外源基因葡萄糖异构酶(gi)的基因、D-阿洛酮糖差向异构酶(dpe)基因与核糖-5-磷酸异构酶(rpiB)基因以及过表达了内源基因半乳糖通透酶(Galp)的基因。其中所述宿主菌为野生或改造过的细菌或真菌，本专利技术优选的所述宿主菌为大肠杆菌。基于上述，在代谢工程菌JM109(DE3)中利用D-葡萄糖合成D-阿洛糖，首先构建表达所需的3个基因，然后依次敲除下列基因：转运果糖磷酸化的pts途径(FruA)基因、转运葡萄糖的磷酸化pts途径(ptsg)基因、葡萄糖激酶(glk)基因，6-磷酸果糖激酶I、6-磷酸果糖激酶II、甘露糖果糖激酶(mak)，确保大多数的D-葡萄糖都转化合成D-阿洛糖，为了不影响工程菌的生长，在培养基中加入甘油供菌生长。在不影响菌种生长的情况下，使之尽可能多产D-阿洛糖。一种利用葡萄糖和甘油生物合成D-阿洛糖的方法，其特征在于：在甘油和葡萄糖共存的情况下，能够实现碳水化合物的共利用，通过敲除ptsG基因与FruA基因，来消除葡萄糖与果糖对甘油利用的抑制，在过表达内源基因Galp基因提高葡萄糖进入细胞的非磷酸化途径，使得葡萄糖能够更快速的进入胞内，进行后续合成反应。进一步，所述的利用D-葡萄糖生物合成D-阿洛糖的方法，包括以下步骤：(1)构建并表达合成D-阿洛糖路径的基因，包括gi,dpe,rpiB；(2)构建及过表达非磷酸途径转移D-葡萄糖的基因Galp；(3)敲除糖酵解途径的基因，即glk、pgi、mak和pfkA/B，敲除ptsG和FruA基因解除ccr效应。所述方法详述如下：进一步，步骤(1)中的基因gi基因来自于链霉菌属，在这里是人工合成，序列参照NCBI，dpe,rpiB分别来源于根癌农杆菌属和热纤梭菌属，参考NCBInumber。构建并表达由D-葡萄糖合成D-阿洛糖的途径，这项工作中，涉及到了关键基因的合成，其中化学合成了葡萄糖异构酶基因(gi)，将D-葡萄糖直接异构为D-果糖；阿洛酮糖差向异构酶基因(dpe)，将D-果糖异构为D-阿洛酮糖；以及核糖-5-磷酸异构酶基因(rpiB)，将阿洛酮糖异构为D-阿洛糖。扩增上述基因然后与载体(pETDuet-1)连接，构建成我们需要的重组质粒pETDuet-1-dpe-rpiB-gi，将重组质粒转染到大肠杆菌JM109(DE3)中，得到可以合成D-阿洛糖的菌株。进一步，步骤(2)中过表达的Galp基因是大肠杆菌自身的基因，用于表达非磷酸化转运葡萄糖的膜蛋白。过表达了Galp基因。为了提高D-葡萄糖转运的非磷酸途径的效率，构建表达了Galp基因，在解除ccr效应后进一步使得非磷酸化效率更高。将上述基因与载体(pRSFDuet-1)连接，构建成我们需要的质粒pRSFDuet-1-Galp，将其转染到上述带有重组质粒pETDuet-1-dpe-rpiB-gi菌株中，构建完成。进一步，步骤(3)在统一菌株中连续敲除基因的顺序必须是FruA，ptsG，敲除之后解除ccr效应，可以实现葡萄糖和甘油共利用。后再敲除pfka，glk，mak，pfkb。来阻断葡萄糖和果糖的消耗。代谢路径中相关基因的敲除。利用Red同源重组来敲除FruA和ptsG(D-葡萄糖和D-果糖进入细胞的磷酸化途径)，敲除这两个基因的目的是，解除ccr效应，又可提高非磷酸化途径的效率，继而后续接着敲除了glk和mak，截断了D-葡萄糖和D-果糖消耗的途径，从而更专注的生产目标产物，最后为了防止碳流的流失，敲除了pfka和pfkb，从而进一步完善通路，提高产物产量。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：在本专利技术中，利用了廉价的葡萄糖和甘油，通过敲除关键基因和过表达特定基因实现多种碳水化合物共利用，在后续截断了葡萄糖和果糖的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用葡萄糖生物合成D-阿洛糖的方法，其特征在于：构建并表达由D-葡萄糖合成D-阿洛糖的途径：葡萄糖异构酶基因(gi)，阿洛酮糖差向异构酶基因(dpe)，以及核糖-5-磷酸异构酶基因(rpiB)，使得大肠杆菌能够合成D-阿洛糖；在此基础上过表达了Galp，敲除了ptsG和FruA来消除ccr效应，之后又敲除了glk和mak，截断了D-葡萄糖和D-果糖消耗的途径；最后为了防止碳流的流失，敲除了pfka和pfkb。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用葡萄糖生物合成D-阿洛糖的方法，其特征在于：构建并表达由D-葡萄糖合成D-阿洛糖的途径：葡萄糖异构酶基因(gi)，阿洛酮糖差向异构酶基因(dpe)，以及核糖-5-磷酸异构酶基因(rpiB)，使得大肠杆菌能够合成D-阿洛糖；在此基础上过表达了Galp，敲除了ptsG和FruA来消除ccr效应，之后又敲除了glk和mak，截断了D-葡萄糖和D-果糖消耗的途径；最后为了防止碳流的流失，敲除了pfka和pfkb。
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【专利技术属性】
技术研发人员：李灏，郑灵洁，范立海，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11