一种紫薇体细胞胚诱导及植株再生的方法技术

本发明专利技术涉及一种紫薇体细胞胚诱导及植株再生的方法，属于观赏植物生物技术领域。本发明专利技术利用紫薇的子叶诱导产生体细胞胚并建立再生植株无性系，主要步骤包括：1、紫薇无菌苗的培养及外植体的选取；2、愈伤组织的诱导；3、胚性愈伤组织的诱导；4、体细胞胚的发生及发育；5、体细胞胚的诱导生根；6、移栽成苗。本发明专利技术提供的观赏植物紫薇的体细胞胚诱导及植株再生方法，为紫薇快繁加速产业化生产，及紫薇遗传转化、基因改良等研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种紫薇体细胞胚诱导及植株再生的方法
本专利技术涉及观赏植物生物
，具体提供一种紫薇体细胞胚诱导及植株再生的方法。
技术介绍
紫薇属千屈菜科紫薇属，是重要的观赏园艺植物。紫薇传统繁殖方式主要为播种繁殖和扦插繁殖，但播种繁殖易产生变异，且繁殖速度较慢，扦插繁殖成活率低。近年来，随着生物技术的发展，组织培养快繁技术成为解决上述问题的重要途径。已经利用紫薇带腋芽的嫩茎或种子为外植体，进行紫薇快繁，并建立了紫薇的快速繁殖体系。国内外研究者开发了紫薇人工种子胶囊单元的生产技术并发现矮生紫薇的外植体以带腋芽茎段的成活率最高。随着细胞生物学和分子生物学等理论与技术的发展，利用体细胞胚胎发生技术，建立无性系是细胞工程中植株再生的重要途径之一。木本植物体细胞胚胎发生研究始于70年代后期，到80年代后期90年代初得到迅速发展。在木本被子植物的体细胞胚胎发生研究中，已经从46科95属大约140多个树种的组织培养中观察到体细胞胚可诱导出再生植株。体细胞胚发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高和操作简单的特点。而且为研究植物细胞的分化、发育、全能性表达和遗传转化、突变体筛选提供了良好的基础。前人对紫薇组织培养和快繁的研究仅局限于用固体培养基来诱导嫩茎或种子萌发丛生芽。关于紫薇体细胞胚发生、发育及生根系统建立的方法，国内外尚无文献报道。因此，利用细胞工程快繁技术开发出一种稳定、可控的紫薇体细胞胚发生、发育及生根体系，对于实现紫薇快繁加速产业化生产奠定理论基础和提供切实可行的方法来说尤为必要；同时，也可以为紫薇的生物技术育种、种质资源保存、快速繁殖、遗传转化建立良好的实验体系。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
为了解决现有技术中的问题，本专利技术提供一种紫薇体细胞胚诱导及植株再生的方法，本专利技术通过自主研发的体细胞胚诱导方法，成功诱导出了胚状体并萌发发育成苗。本专利技术提供一种紫薇体细胞胚诱导及植株再生的方法，包括：步骤1)紫薇无菌苗的培养及外植体的选取；2)愈伤组织的诱导；3)胚性愈伤组织的诱导；4)体细胞胚的发生及发育；5)体细胞胚的诱导生根；6)移栽成苗。进一步地，针对步骤1)，其特征在于，无菌苗的培养具体为：将紫薇的种子在室温条件下用自来水浸泡24-28小时；接种前做表面灭菌处理：75％的酒精浸泡30秒，无菌水冲洗2遍，然后浸入体积分数为0.1％的HgCl2溶液中10分钟，然后用无菌水冲洗5-6遍；将种子接种在MS0培养基上，培养温度为(25±2)℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间12h/d。所述外植体为紫薇无菌苗的子叶。进一步地，针对步骤2)，其特征在于，愈伤组织的诱导具体为：将步骤1)所得无菌苗的子叶剪成1.0～2.0mm的小块，接种在诱导愈伤组织的培养基上，在恒温25℃黑暗条件下诱导愈伤组织。优选的，所述步骤2)中，愈伤组织诱导培养基为：MS+4mg/l2,4-D+1.0mg/lBA。进一步地，针对步骤3)，其特征在于，胚性愈伤组织的诱导具体为：将步骤2)所得的愈伤组织接种在胚性愈伤诱导培养基上，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下诱导胚性愈伤组织。所述胚性愈伤组织诱导培养基为：MS+4mg/l2,4-D+0-1.0mg/lNAA+0-2.0mg/lBA或MS+4mg/l2,4-D+0-1.0mg/lNAA+0-2.0mg/lKT。优选的，所述步骤3)中，胚性愈伤组织诱导培养基为：MS+4mg/l2,4-D+0.2mg/lNAA+1.0mg/lBA。进一步地，针对步骤4)，其特征在于，体细胞胚的发生及发育具体为：将步骤3)所得的胚性愈伤组织接种于体细胞胚发生发育培养基上，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下进行培养。所述体细胞胚发育培养基为：MS+0-4mg/l2,4-D+0-0.2mg/lNAA+0-2.0mg/lBA+0-0.3mg/lIBA或MS+0-4mg/l2,4-D+0.2mg/lNAA+0-2.0mg/lKT+0-0.3mg/lIBA或MS0。优选的，体细胞胚发育培养基为：MS+0.5mg/lBA+0.3mg/lIBA。进一步地，针对步骤5)，其特征在于，体细胞胚的诱导生根具体为：当步骤4)中的幼苗长到3cm以上时，将幼苗接种到诱导生根的培养基中，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下进行培养。所述诱导生根培养基为：1/2MS+1.0mg/lNAA，或1/2MS+0.5mg/lIBA。进一步地，针对步骤6)，其特征在于，移栽成苗具体为：当步骤5)中的幼苗根长达到1.5-2.0cm，有4片真叶展开时，经炼苗后移栽。优选的，所有培养基中的加添的蔗糖浓度均为30g/L，琼脂均为9g/L，pH均为5.7-5.8。此外，本专利技术还公开了以上任一所述的诱导方法在紫薇遗传转化体系建立、原生质体培养、优良无性系繁殖、基因工程和突变体筛选中的用途。本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次提出观赏植物紫薇体细胞胚诱导及植株再生的方法，愈伤组织诱导率及出胚率均接近100％，为紫薇通过体细胞胚发生方式获得再生植株提供了一种方便、快捷和有效的方法，具有较好的社会经济效益。本专利技术处于领先地位，对于实现紫薇体细胞胚的工厂化育苗奠定理论基础和提供切实可行的方法来说尤为必要，也为紫薇的生物技术育种、快速繁殖、遗传转化奠定基础。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为在(2)号愈伤组织诱导培养基中获得的紫薇愈伤组织；图2为培养10天时，在(11)(12)号体细胞胚发生发育培养基中获得的原胚；图3为培养20天时，在(11)号体细胞胚发生发育培养基中获得的球形胚；图4为培养20天时，在(12)号体细胞胚发生发育培养基中获得的球形胚；图5为培养30天时，在(11)(12)号体细胞胚发生发育培养基中获得的心形胚；图6为培养30天时，在(11)(12)号体细胞胚发生发育培养基中获得的鱼雷形胚；图7为培养30天时，在(11)(12)号体细胞胚发生发育培养基中获得的子叶形胚；图8-10为培养30天时，在(11)号体细胞胚发生发育培养基中获得的完整体细胞胚。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术所述内容作进一步详细说明。但不应该将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本专利技术上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或更变，均应包括在本专利技术的范围内。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种紫薇体细胞胚诱导及植株再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)紫薇无菌苗的培养及外植体的选取；2)愈伤组织的诱导；3)胚性愈伤组织的诱导；4)体细胞胚的发生及发育；5)体细胞胚的诱导生根；6)移栽成苗。/n

【技术特征摘要】
1.一种紫薇体细胞胚诱导及植株再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)紫薇无菌苗的培养及外植体的选取；2)愈伤组织的诱导；3)胚性愈伤组织的诱导；4)体细胞胚的发生及发育；5)体细胞胚的诱导生根；6)移栽成苗。


2.如权利要求1所述的方法，针对步骤1)，其特征在于，无菌苗的培养具体为：将紫薇的种子在室温条件下用自来水浸泡24-28小时；接种前做表面灭菌处理：75％的酒精浸泡30秒，无菌水冲洗2遍，然后浸入体积分数为0.1％的HgCl2溶液中10分钟，然后用无菌水冲洗5-6遍；将种子接种在MS0培养基上，培养温度为25±2℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间12h/d。


3.如权利要求1所述的方法，针对步骤1)，其特征在于，所述外植体为紫薇无菌苗的子叶。


4.如权利要求1所述的方法，针对步骤2)，其特征在于，愈伤组织的诱导具体为：将步骤1)所得无菌苗的子叶剪成1.0-2.0mm的小块，接种在诱导愈伤组织的培养基上，在恒温25℃黑暗条件下诱导愈伤组织。
所述愈伤组织诱导培养基优选为：MS+4mg/l2,4-D+1.0mg/lBA。


5.如权利要求1所述的方法，针对步骤3)，其特征在于，胚性愈伤组织的诱导具体为：将步骤2)所得的愈伤组织接种在胚性愈伤诱导培养基上，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下诱导胚性愈伤组织。
所述胚性愈伤组织诱导培养基为：MS+4mg/l2,4-D+0-1.0mg/lNAA+0-2.0mg/lBA或MS+4mg/l2,4-D+0-1.0mg/lNAA+0-2.0mg/lKT。优选为MS+...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩金玲，李向岭，张敏，王健，杨晴，杨敏，
申请(专利权)人：河北科技师范学院，
类型：发明
国别省市：河北;13