一种合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法技术

本发明专利技术涉及一种合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法，属于观赏植物生物技术领域。本发明专利技术利用合欢的真叶、子叶或下胚轴诱导产生体细胞胚并建立再生植株无性系，主要步骤包括：1、合欢无菌实生苗的培养及外植体的选取；2、体细胞胚的诱导；3、体细胞胚的分化；4、体细胞胚的诱导生根；5、移栽成苗。本发明专利技术提供的观赏植物合欢的体细胞胚诱导及植株再生方法，为合欢快繁加速产业化生产，及合欢遗传转化、基因改良等研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法
本专利技术涉及观赏植物生物
，具体提供一种合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法。
技术介绍
合欢(AlbizziajulibrissionDurazz.)又名夜合树，马缨花，芙蓉花树等，为豆科落叶乔木，高达16米。花淡红色，头状花序，多数，排列成伞房状，腋生或顶生。合欢喜光，稍耐荫。喜温暖、湿润气候,耐寒力也较强，能适应多种气候条件，具有很强的生命力。耐干旱瘠薄，但以湿润肥沃的砂质土生长最好。根具根瘤菌，对瘠薄土壤有一定的改良作用,可作为绿化的先锋树种。合欢原产我国黄河、长江及珠江流域各省，华北甚至东北的辽宁省均有栽培。合欢是人们广泛栽培的风景树之一，其树冠成伞形，树皮光滑，羽状叶片优美，昼开夜合，十分清奇。入夏绿荫清幽，绒花吐艳，远看犹如红霞飘落，甚为美观。适于作为行道树，庭院栽植，在公园、池畔、水滨、河岸、小溪旁等。用于点缀风景，自然潇洒，亦可盆栽观赏。合欢树对各种有害气体均有较强的抗性，尤其适于用作大气污染比较严重地区的绿化树种。合欢具有较高的药用价值。合欢也具有丰富的营养价值。同时，合欢的木材纹理通直，结构细密，经久耐用，可制作家具、农具或用于造船建筑。合欢传统繁殖方式主要为播种繁殖和扦插繁殖，但播种繁殖易产生变异，且繁殖速度较慢，扦插繁殖成活率低。近年来，随着细胞生物学和分子生物学等理论与技术的发展，利用体细胞胚胎发生技术，建立无性系是细胞工程中植株再生的重要途径之一。体细胞胚发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高和操作简单的特点。而且为研究植物细胞的分化、发育、全能性表达和遗传转化、突变体筛选提供了良好的基础。前人对合欢组织培养和快繁的研究仅局限于用固体培养基来诱导嫩茎或种子萌发丛生芽。关于合欢体细胞胚诱导和植株再生的研究内容国内外尚无报道。为此，为建立更理想的合欢体细胞胚高频发生系统，提高其繁殖系数，本试验利用合欢不同器官诱导产生体细胞胚，实现植株再生，为快速繁殖提供了一种新途径。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
为了解决现有技术中的问题，本专利技术提供一种合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法，本专利技术通过自主研发的体细胞胚诱导方法，成功诱导出了胚状体并萌发发育成苗。本专利技术提供一种合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法，包括：步骤1)合欢无菌实生苗的培养及外植体的选取；2)体细胞胚的诱导；3)体细胞胚的分化；4)体细胞胚的诱导生根；5)移栽成苗。进一步地，针对步骤1)，其特征在于，实生无菌苗的培养具体为：将合欢的种子在培养箱内培养进行发芽实验，将发芽的种子经无菌处理后接种到培养基中培养，获得无菌实生苗；所述外植体为实生无菌苗的真叶、子叶、下胚轴；所述培养基为：MS+B5+6-BA+IBA。进一步地，针对步骤2)，其特征在于，体细胞胚的诱导具体为：将步骤1)所得无菌实生苗的真叶、子叶或下胚轴剪成1.5-2.0mm的小块，接种在诱导体细胞胚的培养基上，在恒温黑暗条件下诱导体细胞胚。所述步骤2)中，体细胞胚诱导培养基为：MS+2.0mg/l6-BA+0.3mg/lIBA。进一步地，针对步骤3)，其特征在于，体细胞胚的分化具体为：将步骤2)所得的胚性愈伤组织接种在体细胞胚分化培养基上，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下进行培养。所述步骤3)中，体细胞胚分化培养基为：B5+1.0-2.0mg/l6-BA+0.3mg/lIBA或MS+1.0-2.5mg/l6-BA+0.3mg/lIBA，优选为B5+1.5mg/l6-BA+0.3mg/lIBA或MS+1.0mg/l6-BA+0.3mg/lIBA。进一步地，针对步骤4)，体细胞胚的诱导生根具体为：当步骤3)中的幼苗长到3cm以上时，将幼苗接种到诱导生根的培养基中，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下进行培养。诱导生根培养基为：1/2MS+0.5-3.0mg/lNAA或1/2MS+1.0-3.0mg/lIBA。进一步地，针对步骤5)，其特征在于，移栽成苗具体为：当步骤4)中的幼苗根长达到1.5-2.0cm，有3片真叶展开时，经炼苗后移栽。所有培养基中的加添的蔗糖浓度均为30g/L，琼脂均为9g/L，pH均为5.7-5.8。此外，本专利技术还公开了以上任一所述的合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法在合欢遗传转化体系建立、原生质体培养、优良无性系繁殖、基因工程和突变体筛选中的用途。本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次提出观赏植物合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法，为合欢通过体细胞胚发生方式获得再生植株提供了一种方便、快捷和有效的方法，通过该方法在短时间内大量获得再生植株，为木本植物合欢快速繁殖、再生植株体系建立及转基因技术研究提供了物质基础和技术方法。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为外植体在体细胞胚诱导培养基上形成的胚性愈伤组织；图2为外植体在体细胞胚诱导培养基上培养10天时，胚性愈伤组织中形成球形胚性细胞；图3为外植体在体细胞胚诱导培养基上形成的球形胚；图4为外植体在体细胞胚诱导培养基上形成的心形胚；图5为外植体在体细胞胚诱导培养基上形成的鱼雷胚；图6为外植体在体细胞胚诱导培养基上形成的子叶胚；图7为体细胞胚在分化培养基上培养14天后形成胚芽；图8为体细胞胚在分化培养基上分化形成植株。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术所述内容作进一步详细说明。但不应该将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本专利技术上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或更变，均应包括在本专利技术的范围内。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、合欢实生无菌苗的培养及外植体的选取合欢种子来自于河北科技师范学院绿化园区。将合欢的种子用刀片切割(种脐对面)一缺口，在培养箱内培养，温度为25±1℃，进行发芽实验。每天冲洗一遍并换吸水纸。将发芽后的合欢种子用流水冲洗1d后用75％的酒精迅速冲30s，然后浸入体积分数为0.1％的HgCl2溶液中10min，用玻璃棒轻轻的翻动，使材料均匀消毒。在超净工作台上用无菌水冲洗3～5次，将种子接种到MS+B5+0.5mg/l6-BA+0.3mg/lIBA的培养基中。培养温度为(25±2)℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间12h/d。选取实生无菌苗的真叶作为外植体。实施例2、体细胞胚的诱导将实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)合欢无菌实生苗的培养及外植体的选取；2)体细胞胚的诱导；3)体细胞胚的分化；4)体细胞胚的诱导生根；5)移栽成苗。/n

【技术特征摘要】
1.一种合欢体细胞胚诱导及植株再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)合欢无菌实生苗的培养及外植体的选取；2)体细胞胚的诱导；3)体细胞胚的分化；4)体细胞胚的诱导生根；5)移栽成苗。


2.如权利要求1所述的方法，针对步骤1)，其特征在于，实生无菌苗的培养具体为：将合欢的种子在培养箱内培养进行发芽实验，将发芽的种子经无菌处理后接种到培养基中培养，获得无菌实生苗；
所述培养基为：MS+B5+6-BA+IBA。


3.如权利要求1所述的方法，针对步骤1)，其特征在于，所述外植体包括但不限于合欢无菌实生苗的真叶、子叶、下胚轴。


4.如权利要求1所述的方法，针对步骤2)，其特征在于，体细胞胚的诱导具体为：将步骤1)所得无菌实生苗的真叶、子叶或下胚轴剪成1.5-2.0mm的小块，接种在诱导体细胞胚的培养基上，在恒温黑暗条件下诱导体细胞胚；
所述体细胞胚诱导培养基为：MS+2.0mg/l6-BA+0.3mg/lIBA。


5.如权利要求1所述的方法，针对步骤3)，其特征在于，体细胞胚的分化具体为：将步骤2)所得的胚性愈伤组织接种在体细胞胚分化培养基上，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下进行培养。


6.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩金玲，李向岭，张敏，王健，杨晴，杨敏，
申请(专利权)人：河北科技师范学院，
类型：发明
国别省市：河北;13