一种检测新型鸭呼肠孤病毒感染抗体的间接ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种检测新型鸭呼肠孤病毒感染抗体的间接ELISA试剂盒，属于生物技术领域的免疫学检测方法。所述新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的序列如SEQ ID No：2所示。本发明专利技术检测新型鸭呼肠孤病毒感染抗体的间接ELISA试剂盒，能够区分抗体是源于病毒感染还是灭活疫苗免疫，从而可以移除新型鸭呼肠孤病毒感染禽群，进而有效控制新型呼肠孤病毒的传播。

【技术实现步骤摘要】
一种检测新型鸭呼肠孤病毒感染抗体的间接ELISA试剂盒
本专利技术属于生物
的免疫学检测方法，具体涉及一种检测新型鸭呼肠孤病毒感染抗体的间接ELISA试剂盒。
技术介绍
鸭呼肠孤病毒病是由鸭呼肠孤病毒(Duckreovirus，DRV)引起的番鸭、半番鸭、肉鸭(含北京鸭、樱桃谷肉鸭)、麻鸭和鹅等水禽的一种急性传染病，可以分为番鸭呼肠孤病毒(Muscovyduckreovirus,MDRV)和新型鸭呼肠孤病毒(Novelduckreovirus，NDRV)两种基因型。NDRV可以感染番鸭、半番鸭、肉鸭和鹅等多种水禽，引起番鸭“出血性坏死性肝炎”(也称为番鸭”新肝病”)和肉鸭“脾坏死症”。NDRV自然感染引起的死亡率较低，发病鸭耐过后成为僵鸭；并发感染时的发病率和死亡率升高，还可以引起免疫抑制和生长发育障碍，现已成为危害水禽养殖的重要传染病之一。目前，对该病没有商品化的疫苗，灭活疫苗正在临床试验阶段。ELISA方法具有方便、快速、准确等特点，采用该方法开发的试剂盒已被广泛应用于多种动物疫病的快速诊断和检测中。但是，目前已报道检测NDRV血清抗体的ELISA方法并不能区分新型鸭呼肠孤病毒抗体是来自灭活疫苗免疫还是病毒感染，不利于养殖场对该病毒的净化。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测新型鸭呼肠孤病毒感染抗体的间接ELISA试剂盒，能够区分抗体是源于病毒感染还是灭活疫苗免疫，从而可以移除新型鸭呼肠孤病毒感染禽群，进而有效控制新型呼肠孤病毒的传播。本专利技术的目的采用如下技术方案实现：一种检测新型鸭呼肠孤病毒感染抗体的间接ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括包被有新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的酶标板，所述新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的序列如SEQIDNo：2所示。在本专利技术中，所述非结构蛋白p18采用包括如下步骤的方法制备：使所述新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质；所述生物为微生物或植物。在本专利技术中，使所述新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的编码基因在生物中进行表达包括将所述新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的编码基因导入受体微生物，得到表达所述重组新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18。在本专利技术中，所述非结构蛋白p18采用包括如下步骤的方法制备：将p18编码基因插入pET-32a(+)中，然后导入大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达重组菌后得到的所述蛋白质。在本专利技术中，所述新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的编码基因的序列如SEQIDNo：1所示。在本专利技术中，诱导表达条件是用1.0mmol/L的IPTG在37℃诱导6h。在本专利技术中，所述试剂盒还包括洗涤液、稀释液、HRP标记的羊抗鸭IgG(H+L)抗体、新型鸭呼肠孤病毒感染阳性对照血清和阴性对照血清、显色液和终止液；所述HRP标记的羊抗鸭IgG(H+L)抗体购自美国KPL公司，编号为04-25-06。在本专利技术中，所述酶标板采用含有BSA的PBS缓冲液封闭。本专利技术的有益效果是：本专利技术适用于新型鸭呼肠孤病毒感染血清抗体的快速检测，能够区分抗体是源于病毒感染还是灭活疫苗免疫，从而移除新型呼肠孤病毒感染禽群，进而有效控制新型呼肠孤病毒的快速传播。本专利技术试剂盒具有检测灵敏、准确，操作简便、重复性好以及特异性强的优点，成本较低，适合大规模的样品检测，同时检测较为快速，可在5小时左右完成。附图说明图1为重组菌株表达蛋白的SDS-PAGE电泳图谱，M为PageRulerUnstainedProteinLadderMarker，1为纯化的p18重组蛋白。图2为重组蛋白免疫印迹图，M为PageRulerPrestainedProteinLadderMarker；1为纯化的p18重组蛋白的免疫印迹图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。1、下述实施例中的pET-32a(+)为Novagen公司产品(CatNo.69909.3)。实施例1、新型鸭呼肠孤病毒p18重组蛋白的制备(1)p18蛋白基因的克隆新型鸭呼肠孤病毒的非结构蛋白p18蛋白序列如SEQIDNO：2。以新型鸭呼肠孤病毒NDRVSY株(GenBankMK955818toMK955827.)的基因组DNA为模板，以P18-F、P18-R为引物，利用高保真酶PCR扩增非结构蛋白p18蛋白的基因，并在p18蛋白基因两端分别引入限制性酶切位点BamHI和HindIII。P18–F的序列如下：5’-CCAGGATCCATGTCACTCCCGCCAACC-3’(斜体部分是BamHI酶切位点)；P18–R的序列如下：5’-CCAAAGCTTGGCAGTTGTTGATTGTAGAT-3’(斜体部分是HindIII酶切位点)。将扩增得到的目的基因(SEQIDNO：1)克隆到载体pEASY-Blunt(北京全式金生物技术有限公司)中，由南京擎科生物技术有限公司测序，获得成功插入了目的基因的重组质粒，命名为pEASY-Blunt-p18质粒。(2)重组菌构建将pET-32a(+)质粒和pEASY-Blunt-p18质粒分别用限制性内切酶BamHI和HindIII(宝生物工程(大连)有限公司)双酶切，回收酶切后的pET-32a(+)片段和p18基因，用T4DNA连接酶连接回收的片段，得到质粒pET-32a(+)-p18，并转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，采用BamHI和Hind双酶切筛选出阳性重组菌，命名为pET-32a(+)-p18-BL21(DE3)。(3)p18重组蛋白的表达、纯化按体积比为1：100，将重组菌pET-32a(+)-p18-BL21(DE3)菌液接种至500mL、含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，在37℃培养至OD600＝0.8，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，37℃诱导表达6h。将发酵液8000rpm离心15min，取菌体沉淀用0.01M的PBS溶液洗涤2次，再次离心，取菌体沉淀用超声波仪裂解，得到菌体裂解液。将菌体裂解液在4℃、8000rpm离心15min，收集沉淀，将该沉淀采用Ni-NTA琼脂糖柱(GEHealthcare)，按照说明书中方法纯化p18重组蛋白。取纯化后的p18重组蛋白，10μg/孔，采用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用蛋白转印仪转印硝酸纤维素膜，5％的脱脂奶粉溶液37℃封闭3h，0.1％TBST洗涤3次，加入1:2000稀释的新型鸭呼肠孤病毒感染阳性对照血清(实施例2中方法制备)，在37℃孵育1.5h，0.1％TBST洗涤3次，加入1：500稀释的HRP标记的羊抗鸭本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测新型鸭呼肠孤病毒感染抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于所述ELISA试剂盒包括包被有新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的酶标板，所述新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的序列如SEQ ID No：2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测新型鸭呼肠孤病毒感染抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于所述ELISA试剂盒包括包被有新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的酶标板，所述新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的序列如SEQIDNo：2所示。


2.如权利要求1所述检测新型鸭呼肠孤病毒感染抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述非结构蛋白p18采用包括如下步骤的方法制备：使所述新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质；所述生物为微生物或植物。


3.根据权利要求2所述检测新型鸭呼肠孤病毒感染抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：使所述新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的编码基因在生物中进行表达包括将所述新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的编码基因导入受体微生物，得到表达所述重组新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18的微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述新型鸭呼肠孤病毒非结构蛋白p18。


4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘群兴，张小飞，卢凤英，孙华伟，赵莎，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32