一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒及其应用，属于生物工程技术领域。该试剂盒包括采用猪支原体抗原包被的酶标板和兔抗EF‑Tu血清；所述兔抗EF‑Tu血清是采用重组EF‑Tu蛋白免疫新西兰兔，采血分离血清后所得，所述重组EF‑Tu蛋白的序列如SEQ ID NO:4所示。本发明专利技术试剂盒，该方法耗时短、准确性高、能检测灭活疫苗中猪支原体抗原含量。

【技术实现步骤摘要】
一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒及其应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒及其应用。
技术介绍
支原体是能够在自然界独立生存的最小原核生物，迄今分离出的支原体达190余种，遍布于世界各地，种类多，影响面广，危害很大。其中猪支原体在兽医学上是一类重要的病原微生物，支原体病一般发病进程缓慢，发病率及死亡率较低，但能给生产造成巨大的经济损失。如由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)引起的猪支原体肺炎(Mycoplasmalpneumoniaofswine，MPS)，广泛发生于世界各地，临床症状主要为咳嗽和气喘，一般患猪死亡率不高，但严重降低饲料转化率，长期生长发育不良，造成巨大的经济损失。其他可危害猪只健康的还有猪鼻支原体(可引起多发性浆膜炎、关节炎等临床症状，导致猪生长性能下降)、猪絮状支原体(可引起支气管发生轻微病变)、猪滑液支原体(可引起10周龄以上小猪关节炎)等。目前，疫苗接种是预防控制猪支原体感染的关键措施，在疫苗研制过程中，抗原含量是重要的质量控制指标，与疫苗的实际效力密切相关。对于猪支原体抗原含量的测定，通常采用标准的颜色变化单位(CCU)计数法，但这种方法检测的是培养收获时活的支原体的量，因此只适合于活疫苗产品的质量评价，不适合用于灭活疫苗生产及成品疫苗的有效抗原含量检测，同时该方法测定周期长，还会受到检测血清、检测容器、平行数测定、采样时间等影响。现有技术中缺乏能够用于灭活疫苗的高效、准确检测猪支原体抗原含量的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷，提供一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒，以解决支原体传统定量检测方法费时长、准确性低、不能检测灭活疫苗中猪支原体抗原含量的弊端。本专利技术的另一目的是提供以非诊断为目的采用所述试剂盒检测猪支原体抗原含量的方法，该方法耗时短、准确性高、能检测灭活疫苗中猪支原体抗原含量。本专利技术的目的采用如下技术方案实现。一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒，包括采用猪支原体抗原包被的酶标板和兔抗EF-Tu血清；所述兔抗EF-Tu血清是采用重组EF-Tu蛋白免疫新西兰兔，采血分离血清后所得，所述重组EF-Tu蛋白的序列如SEQIDNO:4所示。在本专利技术中，所述酶标板采用猪支原体裂解液进行包被。在本专利技术中，所述重组EF-Tu蛋白是通过诱导表达携带EF-Tu蛋白编码基因的重组菌所得。在本专利技术中，所述酶标板采用猪支原体裂解液进行包被后采用含有明胶的PBS缓冲液封闭。在本专利技术中，所述试剂盒还包括猪支原体抗原菌液标准品、PBST溶液和羊抗兔HRP-IgG、显色液和终止液。在本专利技术中，PBST溶液是含体积百分浓度为0.05％Tween-20的PBS缓冲液；所述羊抗兔HRP-IgG购自武汉博士德生物公司，产品编号是BA1054。在本专利技术中，所述猪支原体包括猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体。本专利技术还提供以非诊断为目的采用所述试剂盒检测的猪支原体抗原含量的方法，包括如下步骤：(1)在猪支原体抗原包被的酶标板中，设置待检样品孔和空白对照样品孔，在待检样品孔中加入待检样品，在空白对照样品孔中加入PBS缓冲液，然后每孔加入兔抗EF-Tu血清，孵育后PBST溶液洗涤；(2)每孔加入羊抗兔HRP-IgG，孵育；(2)PBST溶液洗涤后，加入TMB底物显色液；(3)加入终止液终止反应，在450nm处读取吸光值；(4)根据标准曲线计算猪支原体抗原含量。本专利技术还提供所述试剂盒在检测猪支原体培养物或者猪支原体疫苗产品中抗原含量的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术通用的猪支原体抗原含量快速检测方法实现了对不同支原体含量的测定，检测时间仅需2-4小时，与常用的CCU计数法相比，大大缩短了生产周期，提高了生产效率。(2)本专利技术不仅可检测培养菌液或活疫苗中猪支原体抗原含量，同时可检测浓缩抗原和灭活疫苗中的抗原含量。(3)本专利技术操作简单，重复性好，准确性高，结果判定计算简单。附图说明图1.兔抗EF-Tu血清的鉴定，1：Mhp168全菌蛋白的SDS-PAGE电泳；2：兔抗EF-Tu血清与Mhp168全菌蛋白的WesternBlot鉴定。图2.标准品的标准曲线，横坐标为稀释倍数的对数值(底数为2)，纵坐标为B/B0。图3RP值与CCU测定结果相关性分析，横坐标为CCU的对数值(底数为10)，纵坐标为RP值。图4是不同猪支原体的标准曲线，其中A为猪鼻支原体标准曲线，B为猪絮状支原体标准曲线，C为猪滑液支原体标准曲线，横坐标为稀释倍数的对数值(底数为2)，纵坐标为B/B0。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的试剂及来源：大肠杆菌DH5a购自Takara公司；弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂、IPTG、Tween20均购自美国Sigma-Aldrich公司；96孔可拆卸酶标板购自Solarbio公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、TMB显色液(产品编号为P0209)购自碧云天生物科技有限公司；羊抗兔HRP-IgG购自武汉博士德生物公司(产品编号为BA1054)、其他所用化学试剂均为分析纯。实施例1制备兔抗EF-Tu血清。从NCBI网站分别下载猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体的EF-Tu序列，使用DNAMAN软件进行氨基酸序列的同源性分析，结果显示四种支原体的EF-Tu序列相对保守，同源性91.58％。根据GenBank上公布的猪肺炎支原体(Mhp)168株基因组信息(GenBank登录号CP002274)，设计各EF-Tu同源区域的原核表达引物P1和P2，以扩增EF-Tu序列中猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体同源性较高的片段。P1的核苷酸序列(SEQIDNO:1)如下：5’-CGCGGATCCTTTGATCGTTCCAAAGAACAT-3’。P2的核苷酸序列(SEQIDNO:2)如下：5’-CCGCTCGAGAATAATTTCGGTAACTGTTCC-3’。以Mhp168株基因组DNA作为模板，以P1和P2为引物，PCR扩增1170bp的目的基因，经双酶切、连接后转化大肠杆菌XL10感受态细胞。提取重组质粒进行测序，目的基因的序列如SEQIDNO:3所示，所编码的重组EF-Tu蛋白的序列如SEQIDNO:4所示。将目的基因插入pET-32a载体中，将测序正确的重组质粒转化入BL21感受态细胞，经IPTG诱导后进行原核表达。采用镍柱按照常规方法对重组EF-Tu蛋白进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒，其特征在于包括采用猪支原体抗原包被的酶标板和兔抗EF-Tu血清；所述兔抗EF-Tu血清是采用重组EF-Tu蛋白免疫新西兰兔，采血分离血清后所得，所述重组EF-Tu蛋白的序列如SEQ ID NO:4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒，其特征在于包括采用猪支原体抗原包被的酶标板和兔抗EF-Tu血清；所述兔抗EF-Tu血清是采用重组EF-Tu蛋白免疫新西兰兔，采血分离血清后所得，所述重组EF-Tu蛋白的序列如SEQIDNO:4所示。


2.根据权利要求1所述通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒，其特征在于所述酶标板采用猪支原体裂解液进行包被。


3.根据权利要求1或2所述通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒，其特征在于所述重组EF-Tu蛋白是通过诱导表达携带EF-Tu蛋白编码基因的重组菌所得。


4.根据权利要求3所述通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒，其特征在于所述酶标板采用猪支原体裂解液进行包被后采用含有明胶的PBS缓冲液封闭。


5.根据权利要求4所述通用的猪支原体抗原含量快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括猪支原体抗原菌液标准品、PBST溶液和羊抗兔HRP-IgG、显色液和终止液。


6.根据权利要求5所述通用的猪支原体抗原含量快...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦艳娜，熊祺琰，于岩飞，冯志新，王丽，刘蓓蓓，王佳，郝飞，韩蕊，邵国青，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32