一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法，采用对特定DAF‑2基因突变体秀丽隐杆线虫施加温度调节，使秀丽隐杆线虫体内DAF‑2类胰岛素受体基因的正常工作受到抑制，结合高糖饮食诱导的体内高糖环境，模拟以高血糖及高胰岛素抵抗为特征的二型糖尿病所造成的体内代谢异常，可用于研究高糖胰岛素抵抗状态对机体各种生理生化代谢过程的影响。该动物模型稳定可重复，同时展现高糖及胰岛素抵抗状态，分子水平变化与人体二型糖尿病状态下的高糖氧化应激兼胰岛素抵抗状态类似，可作为秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型为研究二型糖尿病相关生理生化影响的科研工作者提供一种工具，用于研究发病机制和筛选相关药物。

【技术实现步骤摘要】
一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法及应用
本专利技术属于生物
，具体设计一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法及其应用。
技术介绍
二型糖尿病（T2DM）的特征是胰岛β细胞功能异常和靶器官的胰岛素抵抗（Insulinresistance）引起的相对胰岛素缺乏，即机体对胰岛素产生了耐受性。二型糖尿病患者占全球糖尿病患者群体的90％，是糖尿病治疗的重点研究方向。降糖治疗是目前主要的控制T2DM危害的方法，但治疗二型糖尿病的重点是缓解胰岛素抵抗症状。当胰岛素作用与胰岛素分泌无法维持动态平衡时，胰岛素在胰岛素敏感性组织（如肝脏，肌肉和脂肪组织）中的作用及胰腺胰岛β细胞功能会受到影响产生障碍，导致血液中葡萄糖水平异常。当胰岛素抵抗和β细胞功能障碍发展到一定程度，糖耐量不断降低，T2DM就会产生。类胰岛素生长因子受体（Insulingrowthfactorreceptor，IGFR）通路，也称胰岛素受体（Insulinreceptor，IR）通路，在人体内，该信号网络由激活胰岛素和IGF-1的两个紧密相关的酪氨酸激酶受体，胰岛素受体（IR）和IGF-1受体（IGF1R）下游的细胞内信号级联组成，是胰岛素和类胰岛素生长因子发挥作用的主要方式，涉及细胞生长、增殖、分化、凋亡及代谢调节等，不仅是营养代谢过程的核心，还与寿命甚至肿瘤的发生有密切联系。IGFR通路下游包括了一系列著名的营养代谢及细胞功能调控基因，如IRS、PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK、PDK-1、GLUT-4、FOXO、JNK等，是影响胰岛β细胞功能及胰岛素信号作用的重要因素。胰岛素通过胰岛素受体结合激活胰岛素受体底物（IRS），然后将信号发送至PI3K/AKT通路、ERK1/2通路及mTOR通路等，激活葡萄糖转运及转化功能，从而促进葡萄糖摄取、细胞增殖和存活，同时脂质和蛋白质的代谢也与这一系列信号通路的激活相关，从而使胰岛素同时参与到葡萄糖、脂质、蛋白质的代谢中。异常的胰岛素信号转导会引发糖尿病和肥胖症等代谢型疾病，还可能会引发癌症。近年来，秀丽线虫已经应用到现代生物学的众多领域的研究，特别是真核细胞的基本功能和相互作用，成为研究人类疾病发生过程的重要模式生物。由于秀丽线虫体积小，生命周期短，成本低，具有透明性，基因组已解明，这些特征使其成为一个出色的模式生物。秀丽线虫的人类胰岛素受体基因同源物是DAF-2基因，能够以类似胰岛素受体的形式接受类胰岛素信号，调节线虫的生长发育和代谢。当DAF-2基因失活时，会导致胰岛素信号大幅度削弱，引发类似于胰岛素抵抗的状态，而当药物对于DAF-2基因或其通路下游基因有刺激或兴奋效果时，这个状态会得到缓解或治愈。本专利技术采用对特定DAF-2基因突变体秀丽隐杆线虫施加温度调节，使秀丽隐杆线虫体内DAF-2类胰岛素受体基因的正常工作受到抑制，结合高糖饮食诱导的体内高糖环境，建立以兼具高糖及胰岛素抵抗为特征的秀丽隐杆线虫为基础的动物模型，该秀丽隐杆线虫模型稳定可重复，可模拟以高血糖及高胰岛素抵抗为特征的二型糖尿病所造成的体内代谢异常，用于研究高糖胰岛素抵抗状态对机体各种生理生化代谢过程的影响，为研究二型糖尿病相关生理生化影响的科研工作者提供一种工具，用于研究发病机制及筛选相关药物。
技术实现思路
本专利技术主要提供一种简单易行、成本低廉的构建秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的方法，可以在秀丽隐杆线虫体内塑造高糖及胰岛素抵抗状态，可模拟以高血糖及高胰岛素抵抗为特征的二型糖尿病所造成的体内代谢异常，用于研究高糖胰岛素抵抗状态对机体各种生理生化代谢过程的影响，可作为高糖胰岛素抵抗动物模型用于高血糖、胰岛素抵抗及二型糖尿病发病机制研究和相关药物的开发。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供的秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法为：采用对特定DAF-2基因突变体秀丽隐杆线虫施加温度调节，使秀丽隐杆线虫体内DAF-2类胰岛素受体基因的正常工作受到抑制，结合高糖饮食诱导的体内高糖环境，模拟以高血糖及高胰岛素抵抗为特征的二型糖尿病所造成的体内代谢异常。其中，所用特定DAF-2基因突变体为DAF-2(m41)（CGC编号DR1564）或DAF-2(e1370)（CGC编号CB1370）及其他近似的秀丽隐杆线虫DAF-2突变株。其中，所述调节温度为15-26℃。其中，所用高糖饮食为40mmol/LD-葡萄糖。所述对DAF-2基因突变体秀丽隐杆线虫施加温度调节之前，还包括秀丽隐杆线虫的培养与同步化。所述培养与同步化具体为NGM培养基进行培养后，通过次氯酸钠法完成秀丽隐杆线虫同步化后，于26℃下完成Dauer同步，而后进行产卵法同步化，于26℃培养完成生长周期同步，而后完成模型构建。进一步地，将所述构建方法获得的模型构建应用于筛选治疗二型糖尿病药物中。所述二型糖尿病包含高血糖及胰岛素抵抗等特征。进一步地，将所述构建方法获得的模型构建应用于筛选治疗高血糖药物中。所述高血糖是由高糖饮食引发，且体内糖浓度在12mmol/L以上。进一步地，将所述构建方法获得的模型构建应用于筛选治疗胰岛素抵抗药物中。所述胰岛素抵抗是由哺乳动物胰岛素受体同源基因DAF-2的工作异常引发。进一步地，将所述构建方法获得的模型构建应用于研究高血糖及胰岛素抵抗并存的类二型糖尿病状态对机体各种生理生化代谢过程的影响中。同现有技术相比，本专利技术存在以下优势：本专利技术以秀丽隐杆线虫DAF-2突变体为基础，添加特定浓度D-葡萄糖到培养基中塑造高糖环境，并配合特定的温度控制使之呈现类胰岛素抵抗状态，两者同时展现，分子水平变化与人二型糖尿病状态下的高糖氧化应激兼胰岛素抵抗状态类似。并且，在通过次氯酸钠法完成秀丽隐杆线虫同步化后，于26℃下完成Dauer生长期同步，而后进行产卵法同步化，于26℃培养完成生长周期同步，而后完成模型构建，实现了污染清除、生长周期同步、消除环境压迫干扰等目的，以最佳虫体状态开启后续实验。该秀丽隐杆线虫动物模型稳定可重复，可作为高糖胰岛素抵抗动物模型用于研究高糖、胰岛素抵抗及二型糖尿病发病机制的研究和相关药物的筛选。目前研究虽有少数针对高糖或胰岛素抵抗的相关秀丽隐杆线虫动物模型的构建方法，但均存在缺陷，只进行片面性的指标测试。单纯高血糖模型不能直观反映胰岛素抵抗状态下的糖代谢机制，单纯胰岛素抵抗模型完全不能反映高血糖导致的强氧化伤害，这些模型均不能建立全面反映高血糖兼胰岛素抵抗状态下机体情况的模型，也尚未有将高糖模型及胰岛素抵抗模型结合并进行优化的报道。同时，旧模型缺乏造模过程中的反干扰操作，实验结果具有不稳定性，需要进行优化设计。对于高糖胰岛素抵抗模型的设计，需要筛选合适的基底线虫种株，反复测试不同种类、不同用量的高糖饮食的效果，并对触发所需模型状态的条件进行摸索，同时通过实验条件和操作手段的优化避免不必要的因素干扰，使模型稳定可重复，且不产生明显的基础指标偏移，才能完成一个较为成熟的高糖胰岛素抵抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法，其特征在于，采用对DAF-2基因突变体秀丽隐杆线虫施加温度调节，使秀丽隐杆线虫体内DAF-2类胰岛素受体基因的正常工作受到抑制，结合高糖饮食诱导的体内高糖环境，模拟以高血糖及高胰岛素抵抗为特征的二型糖尿病所造成的体内代谢异常。/n

【技术特征摘要】
1.一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法，其特征在于，采用对DAF-2基因突变体秀丽隐杆线虫施加温度调节，使秀丽隐杆线虫体内DAF-2类胰岛素受体基因的正常工作受到抑制，结合高糖饮食诱导的体内高糖环境，模拟以高血糖及高胰岛素抵抗为特征的二型糖尿病所造成的体内代谢异常。


2.根据权利要求1所述的一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法，其特征在于，所述DAF-2基因突变体包括DAF-2(m41)或DAF-2(e1370)中的任意一种，其CGC编号分别为DR1564、CB1370。


3.根据权利要求1所述的一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法，其特征在于，所述调节温度为15-26℃。


4.根据权利要求1所述的一种秀丽隐杆线虫高糖胰岛素抵抗动物模型的构建方法，其特征在于，所用高糖饮食为40mmol/LD-葡萄糖。

【专利技术属性】
技术研发人员：赵超，吴德胜，刘丹，陈逸晗，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35