减毒鼠伤寒沙门菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种减毒鼠伤寒沙门菌，属于基因工程与免疫技术领域，所述减毒鼠伤寒沙门菌缺失自有fnr基因、arcA基因和fliC基因，所述减毒鼠伤寒沙门菌的分类命名为Salmonella enterica SLT39,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M2020499，保藏时间为：2020年9月14日，本发明专利技术还提供了上述减毒鼠伤寒沙门菌的构建方法及其在制备疫苗中应用，本发明专利技术提供的减毒鼠伤寒沙门菌SLT39的LD

【技术实现步骤摘要】
减毒鼠伤寒沙门菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程与免疫
，尤其涉及一种减毒鼠伤寒沙门菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]沙门菌是一种重要的食源性病原菌，可诱发宿主，包括人类、鸟类、哺乳类和爬行类动物发生急性肠炎、菌血症或者长期的慢性感染。根据临床症状可分为伤寒沙门菌和非伤寒沙门菌两类病原体，其中非伤寒沙门菌有2500多种血清型，通常诱发人产生胃肠道症状，包括腹泻和呕吐，但在婴幼儿、老人以及免疫缺陷人群中会诱发严重的高发病率和死亡率的入侵性疾病(如败血症)。鼠伤寒沙门菌是非伤寒沙门菌中导致入侵性疾病的最主要的致病菌之一。随着沙门菌的进化，其感染也会导致健康成年人或沙门菌的长期携带者发生或发展为入侵性非伤寒沙门菌感染。另外，由于抗生素的大量滥用以及环境和食物中抗生素的残留导致沙门菌的耐药性愈来愈多重且普遍，研制高效沙门菌疫苗研究对沙门菌病的防控亦愈来愈重要。
[0003]伤寒沙门菌疫苗Ty21a已被应用于人类来防控伤寒沙门菌的感染，但至今仍无一株批准的可应用于人类的非伤寒沙门菌疫苗，因此非伤寒沙门菌的疫苗研究仍任重道远。另外沙门菌作为兼性胞内菌可在宿主吞噬细胞内形成沙门小体，逃避胞内杀伤作用，从而导致全身感染或形成长期的慢性感染。因此，可同时诱导抗体应答和细胞免疫应答的减毒活疫苗将更适宜于沙门菌病的防控，其所诱导的免疫反应可同时清除定殖于胞内和胞外的沙门菌，并且可提供长期的免疫保护。
[0004]为此，本领域技术人员已经做了很多努力，比如公开号为CN105132350A的中国专利申请，就公开了一种缺失自有rfbB基因和rffG基因的减毒鼠伤寒沙门菌，又比如公开号为 CN105462907A的中国专利申请，公开了一种缺失自有rfbK和cpsG基因的减毒鼠伤寒沙门菌，他们都具有较好的减毒效果和免疫原性。但是，减毒疫苗的开发，需要更丰富的备选靶向基因，以便能获得更优的选择。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一，就在于提供一种新的减毒鼠伤寒沙门菌，以解决上述问题。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是这样的：一种减毒鼠伤寒沙门菌，所述减毒鼠伤寒沙门菌缺失自有fnr基因、arcA基因和fliC基因，所述减毒鼠伤寒沙门菌的分类命名为Salmonella enterica SLT39,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏编号为： CCTCC M 2020499，保藏时间为：2020年9月14日。
[0007]选择合适的毒力基因是构建沙门菌减毒疫苗的前提，而其中最大的挑战在于缺失靶基因后菌株既要高度减毒又要保持良好的免疫原性，因而缺失基因的靶向是十分关键的。本申请的专利技术人经过筛选，发现同时缺失arcA(双组份调控系统调节子)、fnr(延胡索酸盐和硝酸盐还原反应蛋白)及fliC(鞭毛亚单位蛋白)三个基因可大幅降低细菌的毒力，同
时其口服免疫可产生显著的抗体应答和高水平的免疫保护效果。这证实该减毒菌株是一种合适的沙门菌弱毒疫苗候选株。
[0008]本专利技术的目的之二，在于提供上述的减毒鼠伤寒沙门菌的构建方法，采用的技术方案为，采用自杀质粒同源重组方法，缺失鼠伤寒沙门菌ATCC14028的fnr基因、arcA基因和 fliC基因。
[0009]作为优选的技术方案，所述自杀质粒同源重组方法包括以下步骤：
[0010](1)分别构建自杀质粒pRE112
‑
Δfnr、pRE112
‑
ΔarcA和pRE112
‑
ΔfliC；
[0011](2)将步骤(1)构建好的自杀质粒与与鼠伤寒沙门菌ATCC14028菌株进行接合转移，筛选阳性菌落，然后将阳性菌落置于培养基中增殖培养；
[0012](3)通过PCR筛选得到同时缺失fnr基因、arcA基因和fliC基因的突变菌株ATCC14028 (ΔfnrΔarcAΔfliC)。
[0013]作为优选的技术方案，步骤(1)中，自杀质粒的构建方法为：
[0014](1)突变引物设计：根据Genbank公布的来源于鼠伤寒沙门菌ATCC14028全基因组序列，设计用于分别扩增fnr基因、arcA基因和fliC基因的上、下游同源臂的引物；
[0015](2)上、下游同源臂的扩增：采用步骤(1)的引物通过PCR分别对fnr基因、arcA基因和fliC基因的上、下游同源臂进行扩增，得到扩增产物；
[0016](3)上、下游同源臂的融合；将步骤(2)所得的扩增产物采用引物和高保真酶进行 PCR扩增，得到融合片段；
[0017](4)酶切处理：分别用KpnI和SmaI酶酶切步骤(3)所得的融合片段和pRE112质粒，将融合片段和质粒酶切出互补粘性末端，并回收质粒和片段；
[0018](5)连接：利用连接酶将步骤(4)酶切后的融合片段与pRE112质粒连接，过夜，转化SM10λpir大肠杆菌感受态细胞中，待其长出后，进行PCR鉴定，获得阳性重组自杀质粒pRE112
‑
Δfnr、pRE112
‑
ΔarcA和pRE112
‑
ΔfliC。
[0019]作为进一步优选的技术方案，步骤(1)中，每种基因各设计两对扩增引物。
[0020]作为更进一步优选的技术方案，所采用的引物序列如下：
ΔfliC)具有高效减毒、免疫原性强、保护效率高三方面的特性；本专利技术提供的减毒鼠伤寒沙门菌SLT39的LD
50
为2.9
×
109CFU，较野生株ATCC14028具有104倍的减毒，且SLT39以不同剂量免疫小鼠后均可诱导高水平的血清抗体反应和黏膜免疫反应，以108CFU进行免疫可以获得100％的保护，适合作为鼠伤寒沙门菌基因工程减毒疫苗的候选，为活减毒疫苗的开发提供更多的靶向基因的可能性。
附图说明
[0031]图1为PCR鉴定PCR鉴定沙门菌SLT36arcA缺失株的电泳结果图；
[0032]图2为PCR鉴定SLT35、SLT36、SLT38单缺失株和SLT37双缺失株电泳结果图；
[0033]图3为PCR鉴定SLT39三缺失株的基因表型电泳结果图；
[0034]图4为两个DNA片段的扩增电泳结果图；
[0035]图5为SLT35在缺失株中回补fnr基因、在SLT36缺失株中回补arcA基因、在SLT38 中回补fliC基因结果图；
[0036]图6为回补株的运动表型鉴定结果图；
[0037]图7为鼠伤寒沙门菌野生株和各缺失株于感染5天后在小鼠PPs(A)、脾脏(B)和肝脏(C)的定殖水平图；
[0038]图8为ELISA检测减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株SLT39和免疫对照株SLT04两次免疫后针对沙门菌的血清IgG抗体、亚型IgG1和IgG2a应答以及IgG2a/IgG1的比值图；
[0039]图9为ELISA检测免疫后针对鼠伤寒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种减毒鼠伤寒沙门菌，其特征在于：所述减毒鼠伤寒沙门菌缺失自有fnr基因、arcA基因和fliC基因，所述减毒鼠伤寒沙门菌的分类命名为Salmonella enterica SLT39,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2020499，保藏时间为：2020年9月14日。2.权利要求1所述的减毒鼠伤寒沙门菌的构建方法，其特征在于，采用自杀质粒同源重组方法，缺失鼠伤寒沙门菌ATCC14028的fnr基因、arcA基因和fliC基因。3.根据权利要求2所述的减毒鼠伤寒沙门菌的构建方法，其特征在于，所述自杀质粒同源重组方法包括以下步骤：(1)分别构建自杀质粒pRE112
‑
Δfnr、pRE112
‑
ΔarcA和pRE112
‑
ΔfliC；(2)将步骤(1)构建好的自杀质粒转入感受态大肠杆菌后与鼠伤寒沙门菌ATCC14028菌株进行接合转移，筛选阳性菌落，然后将阳性菌落置于培养基中增殖培养；(3)通过PCR筛选得到同时缺失fnr基因、arcA基因和fliC基因的突变菌株ATCC14028(Δfnr ΔarcA ΔfliC)。4.根据权利要求3所述的减毒鼠伤寒沙门菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，自杀质粒的构建方法为：(1)突变引物设计：根据Genbank公布的来源于鼠伤寒沙门菌ATCC14028全基因组序列，设计用于分别扩增fnr基因、arcA基因和fliC基因的上、下游同源臂的引物；(2)上、下游同源臂的扩增：采用步骤(1)的引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵新新，程安春，曾晓丽，侯宇龙，梁圣，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：