一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法；采用滤纸采集给药前及给药后多时间点的动物口腔唾液样本，减重法测定唾液采样重量，干燥后放置于

【技术实现步骤摘要】
一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法


[0001]本专利技术涉及生物样品的检测
，尤其涉及一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法。

技术介绍

[0002]盐酸米诺环素也称二甲胺四环素盐酸盐，是一种广谱抗菌的四环素类抗生素，可用于治疗牙周炎。本研究拟建立一种快速、灵敏、易操作的检测家兔唾液中米诺环素的药物浓度的方法，以研究药物唾液中动力学过程，制定给药时间间隔并指导药物制剂的开发。
[0003]唾液中米诺环素浓度检测方法开发需要克服的障碍主要有1)唾液样品难以定量采集；2)米诺环素易与金属离子络合，影响定量；3)LC-MS/MS法检测中米诺环素易受到基质干扰。因此需要一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决动物唾液中米诺环素的药物浓度检测的方法中样品采集和基质中金属干扰等问题，建立快速、灵敏、易操作的方法，并将验证后的方法应用于家兔给药后米诺环素的唾液药代动力学研究。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]本专利技术包括以下步骤：
[0007]A用滤纸采集给药前及给药后多时间点的服用过受试药物动物口腔唾液样本，减重法测定唾液采样重量，干燥后放置于-20℃存放；
[0008]B对所述滤纸中加入饱和EDTAK2溶液和沉淀剂，所述沉淀剂为甲醇：乙腈按照体积比1:1配置，超声提取10min，涡旋约30s，离心10min取上清液进行LC-MS/MS分析；
[0009]C建立唾液中米诺环素检测的标准曲线；
[0010]D通过所述标准曲线对所述滤纸中的米诺环素含量进行定量检测，并利用对应的所述唾液样本的取样量，计算唾液中药物含量。
[0011]进一步地，所述校准曲线建立的方法包括采用甲醇稀释成系列浓度的米诺环素标准品工作溶液，在空白唾液滤纸滴加10μL各浓度标准曲线工作液(5，10，50，100，500，1000，5000ng/mL)以及50μL内标工作液，干燥后对所述滤纸中加入饱和EDTAK2溶液和沉淀剂，所述沉淀剂为甲醇：乙腈按照体积比1:1配置，超声提取10min，涡旋约30s，离心10min取上清液进行LC-MS/MS分析，获得的不同唾液浓度的标准曲线样品用于标准曲线分析，以米诺环素含量为横坐标，待测物与内标峰面积比之为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，所得直线回归方程即为标准曲线。
[0012]进一步地，所述滤纸为层析滤纸。
[0013]进一步地，采集待检测动物的时间段为0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144、168h。
[0014]进一步地，待检测动物为中型动物或者大型动物。
[0015]与现有技术相比，本专利技术提供了一种定量检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法，具备以下有益效果：
[0016]1、该检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法：通过采用滤纸吸附唾液，减重法定量采样重量，解决了唾液准确采样的难题。以空白唾液建立标准曲线方法学验证，并对唾液样品中药物含量进行测定，用于家兔给药米诺环素后唾液药代动力学的研究；
[0017]2、该检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法：唾液样品采用甲醇直接沉淀蛋白的方法后测定米诺环素，回收率不满足方法学和检测灵敏度要求；本专利技术加入适量EDTAK2，以减少滤纸、溶液及器皿中金属离子的干扰；采用甲醇：乙腈(1:1)作为沉淀剂对唾液中的米诺环素进行超声提取，减少K2EDTA带来的基质效应，提高了检测灵敏度。
附图说明
[0018]图1为本专利技术的米诺环素在空白唾液中的标准曲线；
[0019]图2为本专利技术的家兔给药米诺环素后唾液药物浓度-时间曲线图；
具体实施方式
[0020]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0021]实施例1：家兔给药米诺环素后唾液动力学研究
[0022]主要包括以下步骤：
[0023]S1、制备米诺环素储备液：
[0024]精密称定米诺环素，用甲醇配制内标储备液浓度为1mg/mL，标准品米诺环素为批号IF1800730A，纯度89.9％，广东利玮医药有限公司提供；
[0025]制备内标溶液：
[0026]精密称定内标七氘代米诺环素，用甲醇配制内标储备液浓度为1mg/mL，精密量取储备液，用甲醇逐步稀释成浓度为1000ng/mL的内标溶液备用；内标七氘代米诺环素为批号36936，纯度95％，广东谱恩科学仪器有限公司提供；
[0027]S2、滤纸采集唾液样品：
[0028]将1只家兔编号并称重，米诺环素给药剂量：1mg/只。给药前禁食12～18小时，自由饮水。唾液采集时间点为：于给药前及给药后0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144、168h。取干燥的层析滤纸片称重，沾取唾液后再次称重，减重法称量唾液重量，并将采样滤纸置于EP管中，浓缩离心仪挥干(25℃)后放置于-20℃冰箱存放待处理。
[0029]S3、标准曲线绘制
[0030]取米诺环素标准品储备液，用甲醇稀释成系列浓度的米诺环素标准品工作溶液，取上述标准曲线工作液各10μL于沾有空白家兔唾液的滤纸上，获得Minocycline的不同唾液浓度的标准曲线样品(0.05，0.1，0.5，1，5，10，50ng)，用于标准曲线分析，再分别滴加50μL的内标溶液(1000ng/mL)后继续置于离心浓缩仪中挥干(25℃)，然后向EP管中加入30μL EDTAK2饱和溶液和400μL沉淀剂(甲醇：乙腈(1:1))，涡旋约30s，将EP管置于超声波清洗机中超声提取10min；离心10min(4℃，20200g)，取100μL上清液进行LC-MS/MS分析。
[0031]以米诺环素含量为横坐标，待测物与内标峰面积比之为纵坐标，用加权最小二乘
法进行回归运算，所得直线回归方程即为标准曲线；
[0032]结果显示唾液中米诺环素含量在0.05～50ng范围时，含量与相应比呈良好的线性关系参照图1，相关系数r为0.9977，定量下限为0.05ng；
[0033]S4、未知唾液样品处理：
[0034]取出S2获得的样品，向滤纸上滴加50μL内标工作液(1000ng/mL IS工作液)后继续置于离心浓缩仪中挥干(25℃)，然后向EP管中加入30μL EDTAK2饱和溶液和400μL沉淀剂(甲醇：乙腈(1:1))，涡旋约30s，将EP管置于超声波清洗机中超声提取10min，涡旋约30s，离心10min(4℃，20200g)，取100μL上清液进行LC-MS/MS分析。
[0035]S5、根据S3的LC-MS/MS分析结果获得的标准曲线，分别对步骤S4中的唾液样品中的米诺环素进行定量；所得到的结果分别除以各自唾液重量，获得该时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：A用滤纸采集给药前及给药后多时间点的服用过受试药物动物口腔唾液样本，减重法测定唾液采样重量，干燥后放置于-20℃存放；B对所述滤纸中加入饱和EDTAK2溶液和沉淀剂，所述沉淀剂为甲醇：乙腈按照体积比1:1配置，超声提取10min，涡旋约30s，离心10min取上清液进行LC-MS/MS分析；C建立唾液中米诺环素检测的标准曲线；D通过所述标准曲线对所述滤纸中的米诺环素含量进行定量检测，并利用对应的所述唾液样本的取样量，计算唾液中药物含量。2.根据权利要求1所述的一种检测唾液样品中米诺环素的药物浓度的方法，其特征在于，所述校准曲线建立的方法包括采用甲醇稀释成系列浓度的米诺环素标准品工作溶液，在空白唾液滤纸滴加10μL各浓度标准曲线工作液(5，10，50，100，500，1000，5000ng/mL)以及50μL内标工作液，干燥后对所述滤纸中加入饱和EDTAK2溶液和...

【专利技术属性】
技术研发人员：李敬来，彭俊，张天宏，
申请(专利权)人：国科卓越北京医药科技研究有限公司，
类型：发明
国别省市：