一种新型分子捕获优化探针及其文库构建方法技术

本发明专利技术涉及分子检测技术领域，尤其是指一种新型分子捕获优化探针及其文库构建方法，一种新型分子捕获优化探针，由以下部分组成：靶区域互补序列探针A

【技术实现步骤摘要】
一种新型分子捕获优化探针及其文库构建方法


[0001]本专利技术涉及分子检测
，尤其是指一种新型分子捕获优化探针及其文库构建方法。

技术介绍

[0002]目标序列捕获测序是通过定制感兴趣的基因组区域的探针，与基因组DNA进行杂交，将目标区域DNA富集后进行高通量测序的研究策略。近年来发展起来的捕获技术，如杂交捕获技术，其样本在杂交前被随机打断成200
‑
500bp左右的片段，寡核苷酸探针可能与一些含有部分目标片段的非靶标序列杂交，导致捕获的特异性较差。多重PCR捕获技术是在一个反应体系中同时扩增多个目的片段，扩增子越多，不均一性也越高，PCR扩增的效率使其应用受到一定的限制。
[0003]分子倒置探针(Molecular Inversion Probe，MIP)技术是最新发展起来的一项新型分子靶向捕获技术，该技术通过设计特异的探针对已知特定目的基因组序列进行捕获，将目标区域富集后再进行高通量测序，其具有特异性强、重复性好、操作简单、费用低廉且对DNA完整度要求不高等特点，并且弥补了杂交捕获技术、PCR多重捕获技术等分子捕获手段的不足。分子倒置探针技术的应用越来越广泛，现已应用于单核苷酸多态性(SNP)分型、外显子测序、拷贝数变异、杂合性丢失、体细胞突变、DNA甲基化和可变剪接等方面的研究。然而，分子倒置探针技术在探针设计及文库构建等方面仍存在一些不足，还需要进一步的优化完善。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是提供一种新型分子捕获优化探针及其文库构建方法，操作简单，具有高特异性，有效节约成本，节省时间，对DNA样品的完整度要求不严格，所需DNA样品少、花费低，还能有效较少引物二聚体。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种新型分子捕获优化探针，由以下部分组成：
[0007]靶区域互补序列探针A
‑
单分子标记序列A
‑
正向引物识别序列A
‑
连接序列
‑
反向引物识别序列B
‑
单分子标记序列B
‑
靶区域互补序列探针B；
[0008]所述连接序列为2
‑
12个尿嘧啶核糖核苷酸，缩写为dUTP，所述dUTP的3'端被标记生物素形成生物素标记的dUTP，用于结合链霉亲和素磁珠，所述生物素标记的dUTP间隔分布，所述生物素标记的dUTP之间的间隔为1
‑
10个未标记生物素的dUTP，所述连接序列有1
‑
6个所述生物素标记的dUTP，所述连接序列包含的未标记生物素的dUTP，可被USER酶识别并切割；
[0009]所述连接序列连接靶区域互补序列探针A
‑
单分子标记序列A
‑
正向引物识别序列A和通用引物识别序列2
‑‑
单分子标记序列b
‑‑
靶区域互补序列探针B反向引物识别序列B
‑
单分子标记序列B
‑
靶区域互补序列探针B，形成一个完整的改良新型分子捕获探针，降低分子
刚性，捕获或大或小的目标区域。
[0010]优选地，所述正向引物识别序列A如SEQ ID NO：1，表示为：5'
‑
CTTCAGCTTCCCGATTACGG
‑
3'，所述反向引物识别序列B如SEQ ID NO：2，表示为：5'
‑
GCACGATCCGACGGTAGTGT
‑
3'；
[0011]所述单分子标记序列A用N1‑8表示，所述单分子标记序列B用N9‑
16
表示。
[0012]优选地，每个新型分子捕获优化探针中的所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B是针对靶目标区域的特异性序列，与模板靶序列区域互补；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B之间的距离为1～500bp，最适合的距离为90～200bp；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B的长度分别在14～35个碱基对之间；解链温度55℃～65℃；GC含量35％～75％。
[0013]优选地，每个新型分子捕获优化探针中的所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B是针对靶目标区域的特异性序列，与模板靶序列的反义链区域互补；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B之间的距离为1～500bp，最适合的距离为90～200bp；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B的长度分别在14～35个碱基对之间；解链温度55℃～65℃；GC含量35％～75％。
[0014]优选地，每个新型分子捕获优化探针中的所述单分子标记序列A和单分子标记序列B在每一个探针中的序列是不同的；同时所述单分子标记序列A和单分子标记序列B的序列也是不同的；所述单分子标记序列a和单分子标记序列b的长度分别在4～12个碱基对之间。
[0015]优选地，每个新型分子捕获优化探针不与靶目标区域的任何序列大致上互补；所述正向引物识别序列A和反向引物识别序列B的长度分别在14～30个碱基对之间；所述反向引物识别序列分别与PCR扩增的正向引物和反向引物之间有部分或全部互补；解链温度55℃～65℃，GC含量35～70％。
[0016]优选地，每个新型分子捕获优化探针包含SEQ ID NO.3的核苷酸序列，U2‑
12
表示连接序列。
[0017]优选地，所述SEQ ID NO.3的核苷酸序列为N1‑
8 CTTCAGCTTCCCGATTACGG U2‑
12
GCACGATCCGACGGTAGTGTN9‑
16
，其中U2‑
12
表示连接序列。
[0018]一种新型分子捕获优化探针的文库构建方法，包括以下步骤：
[0019]S1，根据靶目标区域序列设计并合成新型分子捕获优化探针；
[0020]S2，针对捕获的目标区域，靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B可特异性与目标区域模板互补结合，形成含有一个核苷酸至几百个核苷酸缺口的环状结构；
[0021]S3，在步骤S2得到的环状结构中加入4种游离的核苷酸，所述4种游离的核苷酸为dATP、dTTP、dGTP和dCTP，在DNA聚合酶的作用下以靶目标序列为模板填补缺口，DNA连接酶催化探针区域两端的3'，5'
‑
磷酸二酯键，形成完整的环化探针；
[0022]S4，在步骤S3中得到的环化探针中加入链霉亲和素磁珠用于富集捕获目标序列；之后在捕获洗脱后的体系内加入USER酶识别未标记生物素的dUTP用于切断环化探针和未反应的探针；
[0023]S5，用PCR扩增直接产生靶向区域的测序文库，此时的PCR扩增产物即为测序文库；这样扩增产生的PCR产物无需再构建高通量测序文库，可直接进行上机测序，简化步骤节约
时间；其中，所述PCR扩本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：由以下部分组成：靶区域互补序列探针A
‑
单分子标记序列A
‑
正向引物识别序列A
‑
连接序列
‑
反向引物识别序列B
‑
单分子标记序列B
‑
靶区域互补序列探针B；所述连接序列为2
‑
12个尿嘧啶核糖核苷酸，缩写为dUTP，所述dUTP的3'端被标记生物素形成生物素标记的dUTP，用于结合链霉亲和素磁珠，所述生物素标记的dUTP间隔分布，所述生物素标记的dUTP之间的间隔为1
‑
10个未标记生物素的dUTP，所述连接序列有1
‑
6个所述生物素标记的dUTP，所述连接序列包含的未标记生物素的dUTP，可被USER酶识别并切割；所述连接序列连接靶区域互补序列探针A
‑
单分子标记序列A
‑
正向引物识别序列A和通用引物识别序列2
‑‑
单分子标记序列b
‑‑
靶区域互补序列探针B反向引物识别序列B
‑
单分子标记序列B
‑
靶区域互补序列探针B，形成一个完整的改良新型分子捕获探针，降低分子刚性，捕获或大或小的目标区域。2.根据权利要求1所述的一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：所述正向引物识别序列A如SEQ ID NO：1，表示为：5'
‑
CTTCAGCTTCCCGATTACGG
‑
3'，所述反向引物识别序列B如SEQ ID NO：2，表示为：5'
‑
GCACGATCCGACGGTAGTGT
‑
3'；所述单分子标记序列A用N1‑8表示，所述单分子标记序列B用N9‑
16
表示。3.根据权利要求1所述的一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：每个新型分子捕获优化探针中的所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B是针对靶目标区域的特异性序列，与模板靶序列区域互补；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B之间的距离为1～500bp，最适合的距离为90～200bp；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B的长度分别在14～35个碱基对之间；解链温度55℃～65℃；GC含量35％～75％。4.根据权利要求1所述的一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：每个新型分子捕获优化探针中的所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B是针对靶目标区域的特异性序列，与模板靶序列的反义链区域互补；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B之间的距离为1～500bp，最适合的距离为90～200bp；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B的长度分别在14～35个碱基对之间；解链温度55℃～65℃；GC含量35％～75％。5.根据权利要求1所述的一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：每个新型分子捕获优化探针中的所述单分子标记序列A和单分子标记序列B在每一个探针中的序列是不同的；同时所述单分子标记序列A和单分子标记序列B的序列也是不同的；所述单分子标记序列a和单分子标记序列b的长度分别在4～12个碱基对之间。6.根据权利要求1所述的一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：每个新型分子捕获优化探针不与靶目标区域的任何序列大致上互补；所述正向引物识别序列A和反向引物识别序列B的长度分别在14～30个碱基对之间；所述反向引物识别序列分别与PCR扩增的正向引物和反向引物之间有部分或全部互补；解链温度55℃～65℃，GC含量35～70％。7.根据权利要求1所述的一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：每个新型分子捕获优化探针包含SEQ ID NO.3的核苷酸序列，U2
‑
12表示连接序列。8.根据权利要求7所述的一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：所述S...

【专利技术属性】
技术研发人员：张腾龙，杨春燕，杨文娟，李旋，张亮，周启明，
申请(专利权)人：北京求臻医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：