一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法及应用，可有效解决各种胃酸不耐受的益生菌口服过胃后失活或者活性降低，进而造成在肠道定植效率低的难题，以及抑制有害细菌的生长和增殖，恢复和重建肠道屏障，调节肠道菌群，进而实现对结肠炎和结肠炎相关性结肠癌的有效防治问题，首先，培养益生菌，使其产生芽孢，然后通过挤压器提取芽孢衣壳并制备成粒径均一、性质稳定的衣壳纳米材料(Capsid Nano

【技术实现步骤摘要】
一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法及应用


[0001]本专利技术属于药物制剂领域，特别是一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]近年来，益生菌疗法由于其在调节肠道微生物、环境和免疫系统之间的平衡方面具有显著的优势而被广泛应用于多种疾病的临床治疗中。大多数益生菌经口服后难以在极端的胃酸环境中大量存活，因此，能够顺利到达肠道定植并发挥作用的活菌数量得不到保证，从而限制了大多数益生菌在口服给药系统中的应用。芽孢杆菌属作为可以产生芽孢的一类益生菌，不仅可以促进肠道消化，而且可以用于治疗肠道炎症和调节宿主共生菌群并且抑制病原菌的生长。最重要的是，益生菌芽孢被厚厚的疏水性芽孢衣壳包裹，能够抵抗外界环境压力，是生物学中最稳定的静态结构之一，因此在复杂多变的胃肠道环境中具有较高的存活率，进而实现在肠道的高效定植，为体内益生菌递送奠定了基础。但是，益生菌芽孢在肠道内萌发效率不能被很好的控制，而且萌发时释放的离子可能会打破肠道的离子稳态，这限制了益生菌芽孢的广泛使用。综上所述，需要开发一种能够抵抗极端胃肠环境的纳米材料用于益生菌的口服递送。
[0003]受益生菌芽孢自然生理结构的启发，本专利技术中通过简单的压力滤膜挤压器从不同菌株的芽孢中制备具有生物活性的多功能芽孢衣壳纳米生物材料。该方法制备的纳米材料具有较高的抗逆性和良好的抗炎作用。另外，该纳米材料保留了衣壳中的各种结合蛋白和结构域蛋白，对益生菌具有天然的趋近性和亲和力。上述特点为其锚定在各种不耐酸的益生菌表面作为保护性“盔甲”用于益生菌的有效递送提供了有利的依据。因此，本专利技术中制备了一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌的组合物。该系统可以保护益生菌的固有活性不受胃肠道环境的影响，抑制有害细菌的生长，实现益生菌在肠道的竞争性定植以及爆发式增殖，维持肠道黏膜稳态，调节肠道微生物组。这种基于益生菌芽孢衣壳制备的纳米材料锚定在益生菌表面作为其递送中的保护性“盔甲”的益生菌递送系统，具有显著的结肠炎治疗以及结肠炎相关性癌症的防治效果，但至今未见有公开报导。

技术实现思路

[0004]针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本专利技术的目的就是提供一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法及应用，可有效解决各种胃酸不耐受的益生菌口服过胃后失活或者活性降低，进而造成在肠道定植效率低的难题，以及抑制有害细菌的生长和增殖，恢复和重建肠道屏障，调节肠道菌群，进而实现对结肠炎和结肠炎相关性结肠癌的有效防治问题。
[0005]本专利技术解决的技术方案是，一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法，首先，培养益生菌，使其产生芽孢，然后通过挤压器提取芽孢衣壳并制备成粒径
均一、性质稳定的衣壳纳米材料 (Capsid Nano-materials，CNMs)，再将衣壳纳米材料与益生菌在其生长培养基中共孵育，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物；具体步骤如下：（1）培养益生菌：将益生菌冻干粉接种在营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为120~160r/min下进行培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.004%~0.006% MnSO4·
H2O，促进益生菌产生芽孢，使其复苏并生长增殖，当细菌增殖至对数期时，收集菌液，备用；所述的益生菌是芽孢杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、梭菌、酵母菌或肠球菌中的一种；所述的营养肉汁液体培养基是，牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g和NaCl 5.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.0；（2）提取芽孢：将步骤（1）制备的菌液按照营养肉汁液体培养基体积的2-4%接种量，接种于营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为120~160r/min下继续培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.004%~0.006% MnSO4·
H2O，促进益生菌产生芽孢，产生芽孢后，将含有益生菌和芽孢的混合培养液放置在70~90℃烘箱中加热20~40min，放置室温，12000r/min离心15min，收集沉淀；沉淀用质量浓度0.9% NaCl溶液洗涤2~4次，用去离子水重悬，得芽孢溶液，冻干，得芽孢粉末（spore），备用；（3）制备芽孢衣壳纳米材料：将步骤（2）的芽孢粉末，用去离子水分散，配置成菌落单位1
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CFUs的芽孢溶液；将芽孢溶液置于挤压器中，使芽孢溶液强制反复先后通过挤压器内部孔径800nm、400nm、200nm的滤膜或滤板，得粒径均匀的混合溶液，离心，得滤饼，冻干，得芽孢衣壳纳米材料（CNMs）；所述的挤压器为：滤膜挤出器、高压均质机、脂质体挤出器或高压纳米均质机，以及高压超滤中原理相近似仪器中的一种；（4）制备芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物：将步骤（3）得到的芽孢衣壳纳米材料（CNMs）与步骤（1）得到的益生菌菌液置入营养肉汁液体培养基中，室温孵育5~7h，然后用在4℃下10000~12000r/min离心8-12min，得沉淀，沉淀用去离子水洗涤3次，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物。
[0006]所述方法制备的芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物，既保留了芽孢衣壳中的各种结合蛋白和结构域蛋白，又对益生菌具有天然的趋近性和亲和力，能够锚定在益生菌表面，形成一系列纳米材料与益生菌的组合物，粒度均匀，对极端环境耐受性高，生物相容性好，通过抑制IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎因子，起到很好的抗炎作用，而且具有高效通过胃酸环境，实现在结肠的快速定植和增殖的优势，恢复和重建肠道屏障的完整性，维持肠道黏膜稳态，增加肠道菌群的丰富度和多样性，进而达到对炎性肠病和结肠炎相关性结肠炎的有效防治，制备方法简单、生产费用低和胃酸环境稳定，选择提取的益生菌芽孢衣壳纳米材料用来包裹各种不同种类的益生菌，既可以保护益生菌不受胃酸的损坏，又可以促进益生菌在肠道的指数增长和快速定植，调节肠道菌群，增强肠道屏障，为炎性肠病和炎症诱发的癌症治疗提供了新的技术支持，是口服微生态制剂上的创新，有巨大的经济和社会效益。
附图说明
[0007]图1为本专利技术益生菌定植效率比较图。
具体实施方案
[0008]下面通过实施例对本专利技术的具体实施方式作进一步的说明。
[0009]本专利技术在具体实施中，可由以下实施例给出。
[0010]实施例1本专利技术在具体实施中，一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：（1）培养益生菌：将益生菌芽孢杆菌冻干粉接种在营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为140r/min下进行培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.005% MnSO4·
H2O，促进益生菌产生芽孢，使其复苏并生长增殖，当细菌增殖至对数期时，收集菌液，备用；（2）提取芽孢：将步骤（1）制备的菌液按照营养肉汁液体培养基体积的3%接种量，接种于营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法，其特征在于，首先，培养益生菌，使其产生芽孢，然后通过挤压器提取芽孢衣壳并制备成粒径均一、性质稳定的衣壳纳米材料，再将衣壳纳米材料与益生菌在其生长培养基中共孵育，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物；具体步骤如下：（1）培养益生菌：将益生菌冻干粉接种在营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为120~160r/min下进行培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.004%~0.006% MnSO4·
H2O，促进益生菌产生芽孢，使其复苏并生长增殖，当细菌增殖至对数期时，收集菌液，备用；所述的益生菌是芽孢杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、梭菌、酵母菌或肠球菌中的一种；所述的营养肉汁液体培养基是，牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g和NaCl 5.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.0；（2）提取芽孢：将步骤（1）制备的菌液按照营养肉汁液体培养基体积的2-4%接种量，接种于营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为120~160r/min下继续培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.004%~0.006% MnSO4·
H2O，促进益生菌产生芽孢，产生芽孢后，将含有益生菌和芽孢的混合培养液放置在70~90℃烘箱中加热20~40min，放置室温，12000r/min离心15min，收集沉淀；沉淀用质量浓度0.9% NaCl溶液洗涤2~4次，用去离子水重悬，得芽孢溶液，冻干，得芽孢粉末，备用；（3）制备芽孢衣壳纳米材料：将步骤（2）的芽孢粉末，用去离子水分散，配置成菌落单位1
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CFUs的芽孢溶液；将芽孢溶液置于挤压器中，使芽孢溶液强制反复先后通过挤压器内部孔径800nm、400nm、200nm的滤膜或滤板，得粒径均匀的混合溶液，离心，得滤饼，冻干，得芽孢衣壳纳米材料；所述的挤压器为：滤膜挤出器、高压均质机、脂质体挤出器或高压纳米均质机，以及高压超滤中原理相近似仪器中的一种；（4）制备芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物：将步骤（3）得到的芽孢衣壳纳米材料与步骤（1）得到的益生菌菌液置入营养肉汁液体培养基中，室温孵育5~7h，然后用在4℃下10000~12000r/min离心8-12min，得沉淀，沉淀用去离子水洗涤3次，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物。2.根据权利要求1所述的基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）培养益生菌：将益生菌芽孢杆菌冻干粉接种在营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为140r/min下进行培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.005% MnSO4·
H2O，促进益生菌产生芽孢，使其复苏并生长增殖，当细菌增殖至对数期时，收集菌液，备用；（2）提取芽孢：将步骤（1）制备的菌液按照营养肉汁液体培养基体积的3%接种量，接种于营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为140r/min下继续培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.005% MnSO4·
H2O，促进益生菌产生芽孢，产生芽孢后，将含有益生菌和芽孢的混合培养液放置在80℃烘箱中加热30min，放置室温，12000r/min离心15min，收集沉淀；沉淀用质量浓度0.9% NaCl溶液洗涤3次，用去离子水重悬，得芽孢溶液，冻干，得芽孢粉末，备用；
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CFUs的芽孢溶液；将芽孢溶液置于滤膜挤出器（NANOJ EX5滤膜挤出器）中，使芽孢溶液强制反复先后通过挤压器内部孔径800nm、400nm、200nm的滤膜或滤板，得粒径均匀的混合溶液，离心，得滤饼，冻干，得芽孢衣壳纳米材料；（4）制备芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物：将步骤（3）得到的芽孢衣壳纳米材料与步骤（1）得到的益生菌菌液置入营养肉汁液体培养基中，室温孵育5~7h，然后用在4℃下11000r/min离心10min，得沉淀，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王蕾，宋庆龄，张云，张振中，高慧，王珂，郑翠霞，赵洪娟，冯倩华，张红岭，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：