WRKY32调控YFT1表达影响番茄果色及其在番茄品质改良中应用制造技术

本发明专利技术公开了WRKY32调控YFT1表达影响番茄果色及其在番茄品质改良中应用；具体涉及WRKY32通过结合于YFT1启动子区域W

【技术实现步骤摘要】
tomato.Plant Science,2020,300:110637.)。而鉴于EIN2的重要地位，对其上游调控的研究却鲜见报道，因此，筛选调控YFT1表达的上游基因，分析其通过YFT1介导调控番茄果实成熟发育和果色形成机制，对于构建番茄果色形成调控网络以及对番茄果色形成的精准调控和遗传改良都将具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种WRKY32调控YFT1表达影响番茄果色及其在番茄品质改良中应用。
[0007]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0008]本专利技术提供了一种WRKY家族转录因子WRKY32，其特异地结合于YFT1上游启动子的W-box(TTGAC，-784bp～-780bp)和W-box Like(GTCTA，-1306bp～-1302bp)基序，调控YFT1表达，所述的W-box和W-box Like基序及其侧翼序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
[0009]本专利技术提供了一种WRKY家族转录因子WRKY32，其可正调控YFT1的转录表达，所述WRKY32的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0010]本专利技术提供了一种WRKY家族转录因子WRKY32，其可正调控YFT1的转录表达，所述WRKY32的cDNA序列如SEQ ID NO:4所示。
[0011]本专利技术提供了一种下调转录因子WRKY32表达的RNA干扰序列，其可以下调WRKY32的转录表达，所述干扰序列如SEQ ID NO:5所示。所述RNA干扰序列用于构建WRKY32的RNAi载体。
[0012]本专利技术提供了一种WRKY家族的转录因子WRKY32在作为YFT1表达的调控剂中的用途。
[0013]本专利技术提供了一种转录因子WRKY32在调控番茄果色中的应用。其降低番茄果实中类胡萝素含量，改变该途径相关基因表达方式，而改变果实颜色。
[0014]本专利技术提供了一种转录因子WRKY32在调控番茄果实成熟发育中的应用。其反馈调控番茄果实乙烯合成及乙烯合成途径关键基因表达，从而影响番茄果实成熟期的乙烯释放。
[0015]本专利技术提供了一种转录因子WRKY32，其打乱了番茄乙烯信号转导，并通过调控该途径相关表达基因实现，从而可以调控番茄果实成熟进程。
[0016]本专利技术提供了一种转录因子WRKY32在番茄遗传改良和育种中的应用。包括：果实乙烯释放和信号转导受抑、类胡萝卜素含量下降、有色体发育、果实软化速度延迟等。
[0017]本专利技术还提供了一种转录因子WRKY32在调控乙烯信号核心组分YFT1/EIN2(YELLOW FRUITED TOMATO 1/ETHYLENE INSENSITIVE 2)表达而控制番茄果色形成的分子机制研究体系中的应用。
[0018]本专利技术涉及黄果晚熟突变体yft1(yellow fruited tomato 1)和野生型红果cv.M82番茄，均由以色列希伯来大学Dani Zamir教授提供(http://zamir.sgn.cornell.edu/mutateds)。yft1番茄突变体(n3122)系利用快中子(60Coγ-射线)轰击番茄cv.M82种子而获得。WRKY32-RNAi为由RNAi技术下调cv.M82中WRKY32表达水平获得的转基因番茄。本专利技术基于TEA数据库(http://tea.solgenomics.net/)，将相似系数
阈值设定为0.7，共有2386个基因与YFT1(Solyc09g007870)表达模式相似；其中包含85个转录了因子。提交YFT1启动子上游3000bp序列(pYFT1)给PLACE(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action＝newplace)，预测pYFT1顺式调控元件，共检测到23个转录因子预测在pYFT1有可能的靶向结合位点。
[0019]利用双分子荧光素酶活实验(dual luciferase assay)筛选23个候选转录因子，基于与pYFT1结合对其活性的影响，发现：Solyc07g005650编码的转录因子WRKY32可以提高pYFT1强度5.42倍(图1)。为确定WRKY32在YFT1启动子(pYFT1)结合位点，将pYFT1进行三轮分割，第一轮将pYFT1分为12段，每段长约300bp，每段重叠50bp；通过酵母单杂交验证与WRKY32互作的ΔpYFT1片段。根据第一轮实验结果，继续对目的ΔpYFT1片段进行第二、三轮分割，并通过酵母单杂交实验验证，将WRKY32与pYFT1的结合位点缩小至p7-3-2(-1319bp～-1270bp)和p9-3-3(-808bp～-767bp)(以YFT1起始密码子ATG上游第一个核苷酸为-1bp)。2个片段分别含有W-box like(GTCTA，-1306bp～-1302bp)和W-box(TTGAC，-784bp～-780bp)功能区域，可能与WRKY32结合。突变p7(-1549bp～-1250bp)和p9(-1068bp～-767bp)区域的W-box like和W-box基序，即突变成Δp7(GTCTA
→
cTCTA)和Δp9(TTGAC
→
TTtAa)；通过酵母单杂交和EMSA(electrophoretic mobility shift assay)实验验证了WRKY32通过与pYFT1的W-box like(GTCTA，-1306bp～-1302bp)和W-box(TTGAC，-784bp～-780bp)结合(图2和图3)。构建WRKY32的RNAi载体，转化cv.M82获得WRKY32-RNAi转基因番茄。RT-qPCR分析WRKY32和YFT1表达水平发现，WRKY32在cv.M82和yft1突变体果实中表达水平无差异；而WRKY32-RNAi转基因株系中YFT1表达水平显著下调。即WRKY32位于YFT1上游调控其表达(图4)。WRKY32-RNAi转基因番茄果实的成熟延迟，开花后54天(54days past anthesis，54dpa)，果实呈现黄色(图5)。观察有色体超微结构，发现WRKY32-RNAi有色体发育相比cv.M82延迟，质体小球数量也显著下降(图7)。类胡萝卜素途径关键基因PSY1(PHYTOENE SYNTHASE 1)、CRTISO(CAROTENOID ISOMERASE)和CYCB(CHROMOPLAST-SPECIFIC LYCOPENEΒ-CYCLASE)在WRKY32-RNAi中表达水平相比cv.M82的下调(图6)。54dpa，WRKY32-RNAi中番茄红素和β-类胡萝卜素积累量也显著低于cv.M82(表5)。分析WRKY32对乙烯生物学行为的影响发现，乙烯合成关键基因ACS2/4(ACC SYNTHESIS 2/4)和ACO1(ACC OXIDASE)和乙烯信号途径基因NR(NEVER RIPE)、ETR4(ETHYLENE RECEPTOR 4)、CTR1(CONSTIT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种WRKY家族转录因子WRKY32，其特征在于，特异地结合于YFT1上游启动子的W-box和W-box Like基序，调控YFT1表达；特异结合的YFT1启动子W-box和W-box Like基序及其侧翼序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。2.一种WRKY家族的转录因子WRKY32，其特征在于，可以正向调控YFT1的转录表达，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。3.一种WRKY家族的转录因子WRKY32，其特征在于，可以正向调控YFT1的转录表达，其cDNA序列如SEQ ID NO:4所示。4.一种下调转录因子WRKY32表达的RNA干扰序列，其特征在于，可以下调WRKY32的转录表达，所述RNA干扰序列的DNA序列如SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵凌侠，黎宇航，赵伟华，李文贞，温腾健，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：