本发明专利技术开发了一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶的快检新方法，在免疫层析试纸条底板上依次搭接粘贴滤纸、样本垫、喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水纸，制成免疫层析试纸条，然后在离心管底固定Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体复合物，通过磁分离富集目标物，之后以试纸条定量检测样本中的待测物浓度，该方法可超灵敏检测待检物，同时减少样品基质的干扰。干扰。干扰。
【技术实现步骤摘要】
基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶的快检新方法
[0001]本专利技术属于医学检验和食品安全检测领域，具体涉及一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶(Fe3O4@PDA@Pd/Pt)的快检新方法，来定量检测样本中的待测物浓度。
技术介绍
[0002]免疫层析技术是一种基于抗原抗体特异性反应的检测方法，具有检测速度快、特异性好、操作简单和费用低等优点，相比于其它方法更能满足现场大批量检测的需求，因此近年来发展迅猛，被广泛应用于食品安全、医学检验和环境污染物监测等领域。其中胶体金免疫层析试纸条是应用最广泛的一种免疫层析产品，但其灵敏度较差且易受基质干扰。因此近年来的免疫层析技术主要有三个发展方向：一是采用免疫磁分离富集技术从复杂基质中分离浓缩目标物以避免样品基质的干扰；二是通过信号放大系统(如生物素-链霉亲和素系统等)以提高免疫层析方法的灵敏度；三是采用新型标记物(如荧光微球)，提高信号输出或转变信号输出类型，以达到提高灵敏度的目的。
[0003]纳米酶是一类具有酶催化性质的纳米材料，例如贵金属纳米材料、金属氧化物和碳基材料等。相比于传统生物酶，其具备超高的稳定性及酶催化活性，因而广泛应用于临床诊断、生物成像及生物传感器领域。经典的金属纳米酶往往以单一金属组成，例如铂纳米酶和钯纳米酶等，之后又发展了一系列的以碳基材料作为载体的铂碳、钯碳等。近期研究发现，基于双金属协同效应，可大大提高纳米酶的催化活性。
[0004]基质效应是影响实际检测准确性的重要因素。磁分离技术是一种通过免疫磁珠捕获目标物，在外加磁场下磁分离后再分散于一定体积的PBS中的样本前处理方法。通过该技术可以同时达到减弱基质效应和富集目标物的目的。
[0005]基于上述情况，专利技术人通过一锅法合成了一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶(Fe3O4@PDA@Pd/Pt)作为探针，应用于医学检验和食品安全快速检测等领域并提高试纸条稳定性和检测灵敏度。目前，尚未有将Fe3O4@PDA@Pd/Pt作为探针应用于免疫层析法中的相关报道。
技术实现思路
[0006]本专利技术的一个目的是提供一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶Fe3O4@PDA@Pd/Pt的快检新方法。
[0007]本专利技术的另一个目的是提供预固定Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体离心管的制备方法。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0009]本专利技术提供了一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶Fe3O4@PDA@Pd/Pt的快检新方法，它包括预固定Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体离心管的制备和免疫层析试纸条的制备。其中，所述离心管固定有Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体复合物，该离心管的制备方法包括如下步骤：
[0010](1)Fe3O4@PDA@Pd/Pt的制备：将1.0mg Fe3O4(50～500nm)分散于1mL Tris-HCl缓
冲溶液(0.01～0.1M,pH 7～10)中，加入0.2～2.0mg盐酸多巴胺，搅拌反应10～24h后磁分离洗涤得Fe3O4@PDA，然后将Fe3O4@PDA复溶至1mL聚乙烯吡咯烷酮溶液(0.5％)中，加入100μL抗坏血酸(1～100mg/mL)、100μL氯钯酸钠(1～100mM)和100μL氯铂酸钾(1～100mM)，50～90℃加热反应15～45min，磁分离洗涤即得Fe3O4@PDA@Pd/Pt；
[0011](2)Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体的制备：向制得的Fe3O4@PDA@Pd/Pt中加入待标记抗体，混匀后，室温搅拌反应2h，之后，加入封闭剂，室温反应2h，离心取沉淀，得到的沉淀复溶，制成Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体复合物；
[0012](3)预固定Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体的离心管：取制得的Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体复合物滴加至离心管中，30℃真空干燥即可。
[0013]进一步的，所述预固定Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体的离心管中的待标记抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体、噬菌体表达抗体。
[0014]进一步的，步骤(2)中所述Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体的制备包括如下具体步骤：取Fe3O4@PDA@Pd/Pt超声1～10min，再用0.01～0.5M pH 6.0～8.0的硼酸盐缓冲液调节纳米酶浓度至0.01～0.1mg/mL，加入待标记抗体使其终浓度为1～100μg/mL，振荡混匀后，室温搅拌反应2h，之后，加入封闭剂，使其终浓度为0.1～1％，室温反应2h，然后磁分离去上清，沉淀用0.01～0.1M pH 7.4～8.0的磷酸盐缓冲液复溶为起始体积的1/10，制成Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体复合物于4℃保存备用；
[0015]进一步的，本专利技术的硝酸纤维素膜上包被有待测物人工偶联抗原或待测物抗体作为检测线，包被有抗鼠抗体或抗兔抗体(二抗)作为质控线；其中，该硝酸纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：
[0016](1)使用0.01～0.5M pH 6.0～8.0的PBS(磷酸盐缓冲溶液)溶液分别调节包被物待测物人工偶联抗原或待测物抗体、抗鼠抗体或抗兔抗体至浓度为0.01～10.0mg/mL；
[0017](2)将调整浓度后的待测物人工偶联抗原或待测物抗体喷涂于硝酸纤维素膜上部，作为检测线，将抗鼠抗体或抗兔抗体喷涂于硝酸纤维素膜下部，作为质控线；其中，检测线和质控线之间间隔一定距离，二者的喷量均为0.25～0.74μL/cm；
[0018](3)将喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜于37℃过夜烘干处理后，在室温干燥的环境下保存备用。
[0019]进一步的，所述的待测物人工偶联抗原是指小分子待测物与大分子蛋白质通过化学偶联方法制备的具有免疫原性和反应原性的全抗原；其中，所述的小分子待测物涵盖医学检验领域和食品安全检测领域所需要检测的所有小分子物质；所述的偶联方法包括重氮法、碳二亚胺法、戊二醛法、混合酸酐法、琥珀酸酐法；所述的偶联大分子蛋白包括牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白；所述的偶联比为1:5～1:200，偶联后透析纯化，得到所需的人工偶联抗原。
[0020]进一步的，所诉待测物抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体。
[0021]进一步的，所述的免疫层析试纸条的组装，包括以下步骤：
[0022](1)在底板上搭接粘贴下述材料：滤纸、样本垫、喷涂有待测物偶联人工抗原或抗体作为检测线和抗鼠抗体/抗兔抗体作为质控线的硝酸纤维素膜和吸水纸，即组装成本专利技术使用的免疫层析试纸条大板。
[0023](2)组装好的试纸条大板，通过切刀切成需要的宽度，即成本专利技术使用的免疫层析
试纸条，该试纸条可以直接使用，也可以装入塑料卡壳中使用。
[0024]本专利技术提供的一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶Fe3O4@PDA@Pd/Pt的快检新方法的检测过程包括：
[0025]经过本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶的快检新方法，包括免疫层析试纸条和预固定Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体复合物的离心管，其特征在于：所述的预固定Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体复合物的离心管的制备方法包括如下步骤：(1)Fe3O4@PDA@Pd/Pt的制备：将Fe3O4分散于Tris-HCl缓冲溶液中，加入盐酸多巴胺，搅拌反应后磁分离洗涤得Fe3O4@PDA，然后将Fe3O4@PDA复溶至聚乙烯吡咯烷酮溶液中，加入抗坏血酸、氯钯酸钠和氯铂酸钾，加热反应，磁分离洗涤即得Fe3O4@PDA@Pd/Pt；(2)Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体的制备：向制得的Fe3O4@PDA@Pd/Pt中加入待标记抗体，混匀后，4℃反应过夜，之后，加入封闭剂，室温反应2h，磁分离取沉淀，得到的沉淀复溶，制成Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体复合物；(3)预固定Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体复合物的离心管：取上述步骤制得的Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体复合物加入至离心管中，30℃下真空干燥即可。2.根据权利要求1所述的一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶的快检新方法，其特征在于，所述步骤(2)中的Fe3O4@PDA@Pd/Pt在加入待标记抗体前可进行预处理，预处理的步骤包括：将步骤(1)得到的Fe3O4@PDA@Pd/Pt超声1～10min，再用0.01～0.5M pH 6.0～8.0的硼酸盐缓冲液调节Fe3O4@PDA@Pd/Pt浓度至0.01～0.1mg/mL。3.根据权利要求1所述的一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶的快检新方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入待标记抗体后的抗体终浓度为1～100μg/mL，加入封闭剂后封闭剂的终浓度为0.1～1％，且所述封闭剂选自酪蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、聚乙二醇、脱脂牛奶中的任意一种。4.根据权利要求1所述的一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶的快检新方法，其特征在于，所述步骤(2)中磁分离后的沉淀用0.01～0.1M pH 6.0～9.0的磷酸盐缓冲液复溶为起始体积的1倍至1/10倍，即可制成聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶标记抗体复合物，并可于4℃保存备用。5.根据权利要求1所述的一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶的快检新方法，其特征在于，所述Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体。6.根据权利要求1所述的一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶的快检新方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：赖卫华，熊勇华，章钢刚，彭娟，李响敏，刘文娟，伍燕华，
申请(专利权)人：江西维邦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。