紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10及其编码蛋白与应用制造技术

本发明专利技术公开了紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10及其编码蛋白与应用，主要涉及植物基因工程技术领域。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其编码的MsCBL10蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示。本发明专利技术的有益效果在于：该基因在烟草中过量表达可提高转基因烟草植株的干旱和盐胁迫的抗性，该基因可用于其他林草植物的遗传转化，提高其抗逆性。提高其抗逆性。提高其抗逆性。

【技术实现步骤摘要】
紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10及其编码蛋白与应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，具体是紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10及其编码蛋白与应用。

技术介绍

[0002]逆境胁迫，尤其是干旱和盐碱胁迫，是目前人类面临的世界性问题，也是影响作物正常生长发育和限制作物产量的主要环境因子。紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)是属于中等耐盐植物，作为世界上种植最广的豆科牧草，盐碱和干旱等非生物胁迫是严重制约紫花苜蓿生长和品质高低的重要因素。
[0003]随着生物技术的发展，借助植物基因工程手段培育植物新品种已成为现代育种的重要途径，农杆菌介导法是最常用的转基因方法。1986年农杆菌介导的苜蓿转化首次获得成功之后，借助紫花苜蓿的遗传转化体系，苜蓿转基因工作取得了长足的发展。将Alfin1基因转入苜蓿，在过量表达的转基因植株中，苜蓿内源盐诱导基因PRP2的表达上调，同时，过量表达的转基因植株表现出较强的耐盐性(Winicov and Bastola，1999)。不同浓度的NaCl处理转BADH基因苜蓿，转入的BADH基因可以稳定遗传且正常表达，同时，转基因苜蓿的耐盐性明显高于对照(燕丽萍等，2009)。
[0004]植物在生长发育过程中易遭受多种生物或非生物胁迫，因而在长期的进化过程中，它们形成了复杂的防御机制。类钙调神经素B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein，CBL)家族是一类植物中特有的钙感受器，在细胞响应外界生物或非生物胁迫过程中发挥重要作用。当感应到胁迫刺激时，细胞通过增加Ca
2+
流入使胞内的Ca
2+
浓度骤增，这些Ca
2+
浓度的改变会被下游的CBL感知。CBL通过EF手型结构结合Ca
2+
后，构象发生改变并导致分子疏水特性等的改变。通常情况下，这种改变促使CBL与下游CBL互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase，CIPK)结合并使其激活，进一步将信号向下游靶标传递，最终引起植物对胁迫的响应。CBL10是CBL蛋白家族中的重要成员，该蛋白参与植物抵抗高盐、干旱和低温胁迫、调节钾素营养和应对病菌侵染等功能已在多个物种中被证实。PbCBL10参与多种激素和逆境胁迫过程的信号转导，在调控梨树生长发育及响应环境胁迫方面发挥重要作用(许园园等，2014)。NsylCBL10基因可能参与了林烟草在高盐、低钾、高温和干旱四种胁迫的信号转导过程。在拟南芥中，CBL10基因与下游基因CIPK存在相互作用，这一信号途径共同介导了拟南芥植株在盐胁迫下的抗逆性反应(黄连红，2015)。PeCBL10过表达转基因三倍体毛白杨植株比野生型三倍体毛白杨植株在盐胁迫和干旱胁迫下有较强的抗性(李旦旦，2012)。虽然CBL10基因的功能还有待进一步深入研究，但它们在植物遗传工程方面已展现出巨大的应用潜力。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10及其编码蛋白与应用，该基因在烟草中过量表达可提高转基因烟草植株的干旱和盐胁迫的抗性，该基因可用于其他
林草植物的遗传转化，提高其抗逆性。
[0006]本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
[0007]紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
[0008]作为本专利技术的另一个方面，为紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10编码的蛋白，该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0009]作为本专利技术的另一个方面，为紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10在调节植物抗干旱耐盐胁迫中的应用。
[0010]进一步的，具体应用时，将含基因MsCBL10的植物表达载体导入植物细胞或种子，使该基因过量表达，从而获得抗干旱、耐盐胁迫能力高于野生型植株的转基因植株。
[0011]所述植物选自紫花苜蓿、烟草。
[0012]进一步的，上述应用包括以下步骤：
[0013]根据基因MsCBL10序列的过量表达引物，构建获得过量表达载体为pCAMBIA2300-MsCBL10质粒；
[0014]将所述过量表达载体质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，用所得菌液对植物组织进行浸染，使用头孢霉素筛选植株；
[0015]使用头孢霉素诱导生长后，壮苗、移栽。
[0016]进一步的，所述植物组织为烟草叶片。
[0017]进一步的，所述过量表达引物为：
[0018]CBLEF：5
′-
GGGGTACCATGCCTACTCATTCCCCTGATG-3
′
；
[0019]CBLER：5
′-
GCGTCGACTCAATTTCCAGCTTCTGATTTG-3
′
。
[0020]进一步的，构建获得过量表达载体包括：将含有MsCBL10基因的质粒用KpnI和SalI酶切后，与被KpnI和SalI酶切的pCAMBIA2300载体进行连接。
[0021]作为本专利技术的另一个方面，一种通过过量表达基因MsCBL10获得转基因植物的方法，将含基因MsCBL10的植物表达载体导入植物细胞或种子，使该基因过量表达，从而获得抗干旱、耐盐胁迫能力高于野生型植株的转基因植株。
[0022]对比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0023]本专利技术提供了紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10的全长CDS，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。本专利技术提供的MsCBL10基因结构特性分析表明：MsCBL10基因CDS全长为750bp，该基因编码249个氨基酸。原核细胞表达诱导研究表明MsCBL10蛋白大小为28kDa。本专利技术公开的MsCBL10基因为研究苜蓿逆境响应分子机理研究和分子定向育种提供了理论依据。
[0024]本专利技术公开了含有上述的紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10的克隆载体，进一步构建了含有上述的紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10的过量表达载体，最后将构建的植物表达载体通过农杆菌介导法转化到烟草中，筛选获得转基因植株。在干旱和盐胁迫处理下，转基因植株与对照相比表现出了更强的抗逆性，说明该基因参与了植物的抗逆过程。MsCBL10基因的功能鉴定有助于揭示紫花苜蓿的抗逆机制，对苜蓿乃至林草的遗传育种和品种改良都具有重要的意义。
附图说明
[0025]图1为RT-PCR方法获得基因MsCBL10的电泳图，其中M为2000bp Marker，1为PCR产物。
[0026]图2为MsCBL10的蛋白结构域。
[0027]图3为MsCBL10与其他物种的蛋白同源树。
[0028]图4为MsCBL10基因在紫花苜蓿根、茎、叶、花和果实中的表达模式。
[0029]图5为MsCBL10基因在盐胁迫6h、24h和48h后的表达本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。2.紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。3.权利要求1所述的紫花苜蓿逆境响应基因MsCBL10在调节植物抗干旱耐盐胁迫中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，具体应用时，将含基因MsCBL10的植物表达载体导入植物细胞或种子，使该基因过量表达，从而获得抗干旱、耐盐胁迫能力高于野生型植株的转基因植株。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物选自紫花苜蓿、烟草。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：根据基因MsCBL10序...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙超，燕丽萍，韩传明，付莹，刘翠兰，李丽，王翠香，梁燕，韩友吉，梁静，乔艳辉，
申请(专利权)人：山东省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：