一种β-葡萄糖苷酶Ttbgl3及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种β

【技术实现步骤摘要】
一种
β-葡萄糖苷酶Ttbgl3及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶Ttbgl3基因的克隆、原核表达、纯化和对苷类化合物的转化。

技术介绍

[0002]耐热毛栓菌等白腐菌在进化过程中获得了分解难降解木质纤维素的特定酶群，CAZy数据库中有包括糖苷水解酶(GH)在内的不同类型的碳水化合物降解酶。糖苷水解酶(GH)有众多的家族参与了木质纤维素的降解。研究表明，丝状真菌在木质纤维素响应过程中，分布在GH1和GH3家族里的β-葡萄糖苷酶基因表达量显著上调，丝状真菌能合成和分泌β-葡萄糖苷酶等胞外酶来同时和选择性降解木质纤维素。β-葡萄糖苷酶可催化在醛糖或葡萄糖的半缩醛-OH基团与另一种非糖化合物(例如氨基醇、芳基醇或伯、仲、叔醇)的-OH基团之间形成的糖苷键的水解；这种水解作用导致的糖苷键的断裂在各种基本生物过程中的重要作用，并引起了人们的极大兴趣；如工业中异黄酮苷的水解，将无效或低效的大豆异黄酮苷转变为有效的大豆异黄酮苷元，增强其生物活性。β-葡萄糖苷酶在食品生物加工、制药和动物饲料的处理方面也有广泛的应用。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供了一种β-葡萄糖苷酶Ttbgl3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，该酶来源于耐热毛栓菌(Trametes trogii)S0301，本专利技术β-葡萄糖苷酶Ttbgl3同时具有β-葡萄糖苷键和β-葡萄糖醛酸苷键的水解活性，其在pH 5-10、45-55℃下具有较好的催化活性，其还具有较好的金属离子耐受性，Fe
3+
可以使Ttbgl3的活性提高到119.6％；本专利技术β-葡萄糖苷酶Ttbgl3对天麻素、七叶苷、大豆苷、黄芩苷等化合物具有较强的转化能力。
[0004]Ttbgl3全长cDNA为2547bp，编码849个氨基酸多肽，预测蛋白质大小为97kDa；利用NCBI数据库，将Ttbgl3氨基酸序列通过BLAST在线比对；Ttbgl3与来源于Polyporus arcularius的β-葡萄糖苷酶(Pabgl3，ID:TFK93148.1)最接近，同源性为81.74％；另外，来源于Trametes versicolor的β-葡萄糖苷酶，同源性为80.26％(Tvbgl3,ID:XP_008036945.1)；来源于Trametes coccinea的β-葡萄糖苷酶，同源性为79.34％(Tcbgl3,ID:OSD02721.1)；来源于Gelatoporia subvermispora的β-葡萄糖苷酶，同源性为74.30％(Gsbgl3,ID:EMD34486.1)
[0005]本专利技术将β-葡萄糖苷酶Ttbgl3基因和酶切后的pET-28b质粒连接得到含有β-葡萄糖苷酶Ttbgl3基因的重组质粒；将重组质粒转化表达宿主菌Roseeta(DE3)，采用IPTG诱导培养，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni-NTA预装重力柱柱纯化即得β-葡萄糖苷酶Ttbgl3；将β-葡萄糖苷酶Ttbgl3应用在制备稀有苷元及单糖苷化合物中，实验结果显示β-葡萄糖苷酶Ttbgl3具有水解多种糖苷的能力，对天麻素、七叶苷、大豆苷和黄芩苷的具有较强的转化能力；通过同源建模和分子对接，推测β-葡萄糖苷酶Ttbgl3中His85和Lys467两个残基可能为
含有β-葡萄糖苷键的底物的酶结合位点，Glu377和Thr424可能为含有β-葡萄糖醛酸苷键的底物的酶结合位点本专利技术β-葡萄糖苷酶Ttbgl3制备简单，具有市场推广应用的价值。
附图说明
[0006]图1为实施例1本专利技术所述Ttbgl3基因特异性的琼脂糖凝胶图；
[0007]图2为纯化的Ttbgl3的纯度鉴定结果图；图A为不同浓度梯度咪唑洗脱液纯化Ttbgl3蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中泳道M为蛋白Marker(购自北京擎科新业生物技术有限公司，货号TSP021)，泳道1为转化pET28b-Ttbgl3重组载体的Roseeta(DE3)菌株添加最适IPTG浓度(0.05mM)产生的蛋白；2为使用含有25mM咪唑的洗脱液洗脱的蛋白；3为使用含有50mM咪唑的洗脱液洗脱的蛋白；4为使用含有100mM咪唑的洗脱液洗脱的蛋白；5为使用含有200mM咪唑的洗脱液洗脱的蛋白；6为使用含有250mM咪唑的洗脱液洗脱的蛋白；图B为200mM咪唑洗脱液中蛋白超滤浓缩检验图，其中泳道M为蛋白Marker(购自北京擎科新业生物技术有限公司，货号TSP021)，泳道1为转化pET28b载体的Roseeta(DE3)菌株产生的蛋白；泳道2为转化pET28b-Ttbgl3重组载体的Roseeta(DE3)菌株在不添加IPTG诱导剂产生的蛋白；泳道3为转化pET28b-Ttbgl3重组载体的Roseeta(DE3)菌株添加最适IPTG浓度(0.05mM)产生的蛋白；泳道4为IPTG诱导后经超声破碎收集的上清蛋白；泳道5为IPTG诱导后经超声破碎收集的沉淀蛋白；泳道6为上清蛋白经Ni-NTA预装重力柱(生工，货号C600793)纯化，用200mM咪唑的洗脱液洗脱，并用10KDa超滤管(默克，货号UFC9003)浓缩收集至0.16mg/mL的纯酶蛋白；
[0008]图3为β-葡萄糖苷酶Ttbgl3最适反应pH的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位％；
[0009]图4为β-葡萄糖苷酶Ttbgl3最适反应温度的测定结果图，横坐标为温度，单位摄氏度(℃)，纵坐标为相对酶活力，单位％；
[0010]图5为pH稳定性的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位％；
[0011]图6为温度稳定性的测定结果图，横坐标为保温时间，单位分钟(min)，纵坐标为相对酶活力，单位％；
[0012]图7为糖耐受性的测定结果图，横坐标为各种单糖的浓度，单位(mM)，纵坐标为相对酶活力，单位％；
[0013]图8为实施例3本专利技术所述β-葡萄糖苷酶Ttbgl3的定性测定结果中重组酶Ttbgl3以p-NPG为底物的动力学参数；
[0014]图9为β-葡萄糖苷酶Ttbgl3转化天麻素的高效液相色谱图，上图为天麻素的色谱图；下图为转化后的色谱图；图中1：天麻素；1a：4-羟基苯甲醇；
[0015]图10为β-葡萄糖苷酶Ttbgl3转化七叶苷的高效液相色谱图，上图为七叶苷的色谱图；下图为转化后的色谱图；图中2：七叶苷；2a：七叶内酯；
[0016]图11为β-葡萄糖苷酶Ttbgl3转化大豆苷的高效液相色谱图，上图为七叶苷的色谱图；下图为转化后的色谱图；图中3：大豆苷；3a：大豆素；
[0017]图12为β-葡萄糖苷酶Ttbgl3转化黄芩苷的高效液相色谱图，上图为黄芩苷的色谱图；下图为转化后的色谱图；图中4：黄芩苷；4a：黄芩素；
[0018]图13为β-葡萄糖苷酶Ttbgl3水解天麻素的转化产物的质谱分析结果图；
[0019]图14为β-葡萄糖苷酶Ttbgl3水本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β-葡萄糖苷酶Ttbgl3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.编码权利要求1所述β-葡萄糖苷酶Ttbgl3的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：严金平，张宇，曲媛，罗媛，李雪杰，杨旭磊，伊日布斯，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：