一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA及其应用制造技术

本发明专利技术涉及RNA干扰领域，具体涉及一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA及其应用；具体而言，本发明专利技术提供了一种优化的siRNA，该siRNA成功在ZZ型半滑舌鳎雄鱼中对配子发生基因进行了干扰，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA及其应用


[0001]本专利技术涉及RNA干扰领域，具体涉及一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA及其应用。

技术介绍

[0002]半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是比目鱼的一种，属于舌鳎科，舌鳎属，是东北亚地区重要的海水养殖鱼类。半滑舌鳎以其肉质鲜美，口感爽滑而深受消费者喜爱，成为海水养殖鱼类中的名贵品种。半滑舌鳎存在明显的雌、雄生长差异，雌鱼生长可比雄鱼大2-4倍，因此养殖中提高雌鱼比例对于产量提升具有重要意义。半滑舌鳎属于ZW性别决定类型，即理论上讲，ZW基因型将发育为雌鱼，ZZ型发育成雄鱼。然而在实际生产中，有相当一部分的ZW个体会性逆转为“伪雄鱼”，伪雄鱼性成熟后，只产生Z型精子，伪雄鱼(ZW，
♂
)与雌鱼(ZW，
♀
)后代中的ZW个体也更容易变为伪雄鱼，由于伪雄鱼生长和雄鱼相似，这极大限制了舌鳎产业的发展。
[0003]配子发生是进行性别控制的关键，如解决上面提到的伪雄鱼配子发生异常，或控制雌鱼Z型和W型卵子比例，均可实现性别的人工干预。鉴于此，通过基因组测序和甲基化组分析，筛选了一批半滑舌鳎配子发生相关基因，其中发现一个位于Z染色体上的neurl3与精子发生密切相关。neurl3在性腺中高表达，其中在雄鱼精巢中表达量最高，伪雄鱼精巢次之，雌鱼卵巢中基本检测不到表达。我们通过体内RNA干扰实验，在伪雄鱼中对neurl3实现了敲低，发现精子发生相关基因的转录水平发生了变化，然而，在我们更感兴趣的雄鱼中，却未能对neurl3实现成功敲降(Xu,W.,Li,H.,Dong,Z.,et al.Ubiquitin ligase gene neurl3 plays a role in spermatogenesis of half-smooth tongue sole(Cynoglossus semilaevis)by regulating testis protein ubiquitination.Gene.2016,592:215
–
220.)。
[0004]基因敲除是研究基因功能的有效工具，但由于半滑舌鳎性成熟周期较长(雄鱼1年，雌鱼2年)，获得纯合基因敲除个体的时间和人力成本则相应增加。因此，在现有基础下优化干扰技术，在半滑舌鳎发育早期建立有效的RNA干扰技术并进行长期应用，可有效缩短研究周期，尽快获得相关表型，对研究配子发生相关的功能基因具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA及其应用。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA，所述siRNA的正义链的序列为：5
’
gcgucuggguuucacaaau3
’
，所述siRNA的反义链的序列为：3
’
cgcagacccaaaguguuua5
’
。
[0007]“siRNA(小干扰RNA，短干扰RNA或沉默RNA)”是一种短的双链RNA，人工引入细胞以诱导特定基因mRNA的降解，从而阻止蛋白质翻译并导致RNA抑制基因表达的干扰。
[0008]进一步的，所述siRNA的末端还含有dTdT的结构，优选的，在siRNA的3
’
端含有dTdT
的结构。
[0009]另一方面，本专利技术还提供了包含上述siRNA的生物制剂。
[0010]在一个实施方式中，所述生物制剂选自载体，优选的，所述载体包括病毒、脂质体。
[0011]另一方面，本专利技术还提供了上述siRNA或生物制剂在干扰半滑舌鳎配子发生基因中的应用。
[0012]本专利技术中的干扰表现为可以降低或敲低或抑制所述基因的表达。
[0013]在一个实施方式中，所述半滑舌鳎配子发生基因选自neurl3基因(基因ID:103398139)、tesk1基因(基因ID：KF939086.1)中的一种或任意几种。
[0014]在其他的实施方式中，所述siRNA或生物制剂还可以干扰精巢发育相关基因gsdf基因(基因ID：103390401)。
[0015]在优选的实施方式中，所述半滑舌鳎为ZZ型半滑舌鳎雄鱼。
[0016]另一方面，本专利技术还提供了一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的方法，所述方法包括利用上述siRNA或生物制剂对半滑舌鳎配子发生基因进行干扰的步骤。
[0017]在一个实施方式中，所述半滑舌鳎配子发生基因选自neurl3基因、tesk1基因中的一种或任意几种。
[0018]在其他的实施方式中，本专利技术还提供了一种干扰半滑舌鳎精巢发育相关基因gsdf基因的方法，所述方法包括利用上述siRNA或生物制剂对所述基因进行干扰的步骤。
[0019]在优选的实施方式中，所述半滑舌鳎为ZZ型半滑舌鳎雄鱼。
[0020]另一方面，本专利技术还提供了上述siRNA在制备用于干扰半滑舌鳎配子发生基因的试剂、组合物、生物制剂或试剂盒中的用途。
[0021]本专利技术通过对neurl3基因的siRNA的优化，成功在ZZ型半滑舌鳎雄鱼中对配子发生基因进行了干扰，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0022]图1.采用不同的siRNA对半滑舌鳎雄鱼进行干扰后的neurl3的表达量(*表示显著性差异，p<0.05)；其中，实验组1为本申请的siRNAs(si-neurl3，图中显示为优化siRNA)，实验组2为专利技术人前期实验中采用的针对neurl3的siRNA(图中显示为原siRNA)，对照组为siRNA(si-GFP)。
[0023]图2.对neurl3进行干扰后对其它雄性相关基因的表达影响(*表示显著性差异，gsdf,p<0.05)；其中，实验组为本申请的siRNAs(si-neurl3)，对照组为siRNA(si-GFP)。
[0024]实施方式
[0025]下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。
[0026]根据neurl3序列和前期的结果(Xu,W.,Li,H.,Dong,Z.,et al.Ubiquitin ligase gene neurl3 plays a role in spermatogenesis of half-smooth tongue sole(Cynoglossus semilaevis)by regulating testis protein ubiquitination.Gene.2016,592:215
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220.)，我们重新设计了针对neurl3特异性的siR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干扰半滑舌鳎配子发生基因的siRNA，其特征在于：所述siRNA的正义链的序列为：5
’
gcgucuggguuucacaaau3
’
，所述siRNA的反义链的序列为：3
’
cgcagacccaaaguguuua5
’
。2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA的末端还含有dTdT的结构，优选的，在siRNA的3
’
端含有dTdT的结构。3.包含权利要求1或2所述的siRNA的生物制剂。4.权利要求1或2所述的siRNA或权利要求3所述的生物制剂在干扰半滑舌鳎配子发生基因中的应用。5.根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐文腾，陈松林，崔忠凯，刘洋，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：