液滴数字PCR芯片、检测系统、检测方法和制造方法技术方案

本发明专利技术涉及一种液滴数字PCR芯片、检测系统、检测方法和制造方法。该液滴数字PCR芯片包括芯片本体，芯片本体开设有依次连通的注液池、液滴生成池、流通池和液滴存储池，及与注液池连通的第一驱动源，注液池底部由一隔膜组成；液滴生成池具有液滴生成腔；注液池一端开设注样口、另一端延伸至液体生成腔内，并在注液池与液滴生成腔连通路径形成第一毛细管路；第一驱动源能够驱动隔膜弹性舒张和收缩，以将注液池内的液体经过第一毛细管路从液滴生成腔内挤出形成液滴。该芯片可将芯片直接进行PCR反应，无需二次转移液滴，更好地维持液滴的状态，有利于PCR的进行，提高检测的效率和准确率，在液滴数字PCR装置中有广泛的应用前景。在液滴数字PCR装置中有广泛的应用前景。在液滴数字PCR装置中有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
液滴数字PCR芯片、检测系统、检测方法和制造方法


[0001]本专利技术涉及微流控液滴数字聚合酶链式反应
，尤其涉及一种液滴数字PCR芯片、检测系统、检测方法和制造方法。

技术介绍

[0002]液滴数字PCR是在传统的PCR扩增前利用微流控芯片对样品进行液滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。每一个芯片可以产生上百万个液滴，其中液滴的大小以及液滴间是否有重叠均会影响检测结果。
[0003]实时荧光定量PCR(以下简称qPCR或qRT-PCR)技术是一种在DNA扩增反应中以荧光化学物质测每次PCR循环后产物总量的方法，其中，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。由于qPCR技术具有准确度高，线性范围宽等优势，因此，己经广泛地用于分子诊断、疾病研究、临床医学等领域。
[0004]目前，液滴数字PCR过程一般为加入PCR试剂和油相，在液滴生成仪中生成微滴，再利用移液枪将产生的微滴移至96孔板中进行PCR反应，最后利用读取仪进行荧光检测。该过程中需要将产生的微滴进行转移，很有可能破坏微滴的大小和内环境，同时对操作者的操作要求高，需要花费时间精力；其次，液滴在96孔板中呈堆叠式分布，在后续检测中需要将液滴在单个独立分开进行荧光检测；并且，在PCR过程中需要长时间的加热，油相容易在加热过程中产生气泡，从而会破坏微滴结构，造成检测失败。
[0005]此外，通常遵循传统PCR的扩增原理，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量检测溶液中模板的原始拷贝数的依据。利用TaqMan探针测定PCR扩增产物的荧光曲线时，需要PCR扩增产物达到10“个拷贝/微升的饱和量，为了使10μ1的PCR反应体系在30个循环后达到这样的产物浓度，PCR反应体系至少需要103个起始模板量。如果将PCR的体积减少至10纳升(n1)，则单个模板就可以在经30个PCR循环后被检测到。
[0006]现有的一般采用PDMS和玻璃片作为微流控芯片的材料，亦即作为微液滴的产生芯片。其中如此得到的微液滴尺寸具有均匀、界面稳定、PCR反应效率高等优点，但由于使用PDMS作为芯片材料，而PDMS材料的透气性特别好，透水性也会有，因此在这种芯片上直接进行PCR会导致PCR反应液蒸发而造成结果不准确。并且该芯片只具有液滴生成功能，而没有对反应产物进行检测的功能，所以该芯片的功能并不完整。另外，所述芯片还在3个试剂注入口均设置了单相液滴成型微结构，结构较为复杂。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了一种液滴数字PCR芯片，集成了液滴生成和单层液滴平铺的功能，直接将芯片放置在PCR仪中即可使其中的液滴进行PCR反应，无需再次转移生成的
液滴，更好地维持液滴的状态，有利于PCR的进行；液滴均为单层平铺，液滴间不会产生重叠，后续检测方便，提高检测的效率和准确率。
[0008]本专利技术提供一种液滴数字PCR芯片，包括芯片本体，所述芯片本体上设置有液滴形成单元，所述液滴形成单元开设有依次连通的注液池、液滴生成池、流通池和液滴存储池；
[0009]所述注液池用于盛放样品稀释液；
[0010]所述液滴生成池具有液滴生成腔；
[0011]所述注液池一端开设注样口、另一端延伸至所述液体生成腔内，并在所述注液池与所述液滴生成腔连通路径形成第一毛细管路；
[0012]所述芯片本体还包括与所述注液池连通的第一驱动源，所述注液池底部由一隔膜组成，所述第一驱动源能够驱动所述隔膜弹性舒张和收缩，以将所述注液池内的液体挤入所述第一毛细管路，并从所述液滴生成腔内挤出形成液滴；
[0013]所述流通池一端开设有注油口、另一端开设出油口，通过所述注油口向所述液滴生成单元注入油液，通过所述出油口回收所述油液；
[0014]所述液滴存储池用于承接生成的液滴并进行PCR扩增反应。
[0015]进一步的，所述芯片本体包括设置于所述第一毛细管路末端的第一止回结构；所述第一止回结构位于所述第一毛细管路与所述注液池连通一端，用于阻止所述第一毛细管路内的液体流入注液池内。
[0016]具体的，所述第一毛细管路包括设置于其与所述注液池连通一端的大端及延伸至所述液滴生成腔内的小端，所述第一止回结构设置于所述大端上；所述第一止回结构包括若干弹片，所述弹片的一端固接于所述大端内壁、另一端向所述小端延伸，且每相邻两个弹片朝向所述小端的一端相互抵靠。
[0017]具体的，所述芯片本体还包括设置于所述注样口的第二止回结构，以阻止所述注液池内的液体返流。
[0018]具体的，所述注液池还形成一排气管路，所述排气管路竖直设置于所述注液池顶部；所述注液池还包括设置于其内壁底部的注样板，所述注样口设置于所述注液池底部；所述注样板一端延伸至所述注样口、另一端延伸至抵近所述大端，所述注样板与所述隔膜之间形成第二毛细管路。
[0019]更具体的，所述液滴生成池还具有与所述液滴生成腔连通的液滴平铺腔，由所述液滴生成腔生成的多个液滴进入并平铺在所述液滴平铺腔内；所述芯片本体还包括第二驱动源，所述第二驱动源驱动所述流通池内的油液流动。
[0020]本专利技术还提供一种液滴PCR检测系统，包括所述的液滴数字PCR芯片，用于PCR扩增反应的循环加热装置，及检测装置。
[0021]具体的，所述检测装置包括：PMT光电倍增管模块和检测装置。
[0022]本专利技术还提供一种液滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：
[0023]S1、将油相添加到流通池中，PCR起始反应液通过注样口注入加样至注液池中；
[0024]S2、分别在所述流通池和所述注液池施加气压并持续特定时间，以便使分别来自流通池和PCR起始反应液储液池的液体汇合而生成大量大小均匀的小液滴；
[0025]S3、当所述生成的液滴都汇入所述液滴储存池后进行PCR扩增反应(203)；
[0026]S4、当PCR扩增反应结束后，读取PCR反应结果。
[0027]本专利技术还提供一种所述的液滴数字PCR芯片的制造方法，包括以下步骤：
[0028]S51、将所设计的图形进行掩膜版加工：将图形按等比例大小复制到一块菲林版或福版上，待进行后续模具加工；
[0029]S52、采用塑模法取图形：运用微加工技术在一块基板上加工凸起的模型作为模具，将复制的图形材料剥离开得到所需要的通道图形；其中模具的制取过程如下：首先在清洁的基底上溅射一层Cr/Ag，然后在金属层上甩上一层光刻胶，利用步骤一的掩膜版进行光刻图形化、显影，最后在清水中进行震荡过程，得到最终的刻有该图形的模具；
[0030]S53、将配制好的聚碳酸和环烯烃共聚物浇灌在模具上，对模具上的微图形进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种液滴数字PCR芯片，其特征在于，包括芯片本体，所述芯片本体上设置有液滴形成单元，所述液滴形成单元开设有依次连通的注液池、液滴生成池、流通池和液滴存储池；所述注液池用于盛放样品稀释液；所述液滴生成池具有液滴生成腔；所述注液池一端开设注样口、另一端延伸至所述液体生成腔内，并在所述注液池与所述液滴生成腔连通路径形成第一毛细管路；所述芯片本体还包括与所述注液池连通的第一驱动源，所述注液池底部由一隔膜组成，所述第一驱动源能够驱动所述隔膜弹性舒张和收缩，以将所述注液池内的液体挤入所述第一毛细管路，并从所述液滴生成腔内挤出形成液滴；所述流通池一端开设有注油口、另一端开设出油口，通过所述注油口向所述液滴生成单元注入油液，通过所述出油口回收所述油液；所述液滴存储池用于承接生成的液滴并进行PCR扩增反应。2.根据权利要求1所述的液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述芯片本体包括设置于所述第一毛细管路末端的第一止回结构；所述第一止回结构位于所述第一毛细管路与所述注液池连通一端，用于阻止所述第一毛细管路内的液体流入注液池内。3.根据权利要求2所述的液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述第一毛细管路包括设置于其与所述注液池连通一端的大端及延伸至所述液滴生成腔内的小端，所述第一止回结构设置于所述大端上；所述第一止回结构包括若干弹片，所述弹片的一端固接于所述大端内壁、另一端向所述小端延伸，且每相邻两个弹片朝向所述小端的一端相互抵靠。4.根据权利要求3所述的液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述芯片本体还包括设置于所述注样口的第二止回结构，以阻止所述注液池内的液体返流。5.根据权利要求4所述的液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述注液池还形成一排气管路，所述排气管路竖直设置于所述注液池顶部；所述注液池还包括设置于其内壁底部的注样板，所述注样口设置于所述注液池底部；所述注样板一端延伸至所述注样口、另一端延伸至抵近所述大端，所述注样板与所述隔膜之间形成第二毛细管路。6.根据权利要求1-5任一项所述的液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述液滴生成池还具有与所述液滴生成腔连通的液滴平铺腔，由所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王涣，王军，王朋帅，
申请(专利权)人：绍兴市高砚智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：