再生及转殖大麻的方法技术

本发明专利技术公开一种大麻的体外克隆繁殖、再生及转殖的方法。本发明专利技术亦公开将此种方法用于改善大麻品种的用途，例如通过育种。例如通过育种。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】再生及转殖大麻的方法
[0001]本申请要求于2018年6月7日提交美国临时专利申请案第62/681,697号的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
[0002]序列表声明
[0003]建立于2019年6月5日且标题为77944序列表.txt的包括49,173个字节的ASCII文件与本申请同时提交，其全部内容通过引用结合在本申请中。
[0004]
及
技术介绍

[0005]本专利技术的一些实施例，涉及一种再生及转殖大麻的方法。
[0006]寻常大麻L.(Cannabis sativa L.)是一年生草本植物。其是最早起源于中亚的栽培植物之一。其被视为是一食品、石油、纤维、药用及休闲用药物的来源，因此已经散布于世界各地。寻常大麻(大麻)中含有大麻素，其是一类独特的萜酚化合物，主要积累在植物的腺毛中。从大麻中已分离出超过100种大麻素，主要的生物活性化合物为Δ9-四氢大麻酚，通称为THC。
[0007]植物的遗传转殖技术的发展已在朝向具有增强的生产特性，例如除草剂、昆虫及抗病性的植物进行遗传性设计方面产生巨大的进步。数种转基因植物的商业品种已被释放。利用生物技术策略可进一步促进具有经性状改良的新大麻品种的发展。许多大麻品种的雌雄异株的生命周期使为改善诸如抗病虫害的特定性状而进行的育种工作变得复杂。开发用于再生大麻幼苗的组织培养系统及农杆菌介导的转殖方案将允许利用更多的遗传多样性来改良植物，并有助于具有理想性状的植物的无性繁殖。
[0008]关于大麻的组织培养的报道很少。此等研究大多数旨在开发一种细胞培养系统以获得次生代谢产物，特别是大麻属所特有的一类大麻素(特纳等人，1980)。愈伤组织培养物(汉普希尔等人，1978、海特里希及拜恩德，1982)及悬浮培养物(维利及格内斯特，1972、伊特克瓦等人，1977、哈特塞尔等人，1983、罗等人，1983、布雷默及帕里斯，1987)已被建立并用于次生代谢产物的提取及生物转殖的研究。
[0009]已描述通过刺激结节上的腋芽或在茎顶上诱导不定芽来体外繁殖苜蓿植物的方法(拉塔等人，2009.vitro Cell Dev Biol Plant.45，12-19.doi：10.1007/s11627-008-9167-5、王等人，2009.Pak J.Bot.41，603-608)。结果表明，微繁殖植物是遗传稳定的。因此，所述方法对于此重要作物的无性繁殖是合适且有用的(拉塔等人，2010.Planta Med.76，1629-1633doi：10.1055/s-0030-1249773、拉塔等人，Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants.3(2016)18-26)。
[0010]亦已开发通过合成的种子技术繁殖大麻的方案。根据此程序，将腋芽或结节封装在藻酸钙珠粒中(拉塔等人，2009.Physiol Mol Biol Plants.15，79-86doi：10.1007/s12298-009-0008-8、拉塔等人，2011.Biotechnol.Lett.33,2503-2508,doi：10.1007/s10529-011-0712-7)，之后可将其存储并随后用于植物的克隆繁殖。此系统显示即使在储存6个月后，此系统仍可以使同质的且遗传稳定的大麻植物生长(拉塔等人，2011.Biotechnol.Lett.2503-2508doi：10.1007/s10529-011-0712-7)。
[0011]器官的再生，尤其是茎，可能非常麻烦，因此必须进行不同的植物生长调节剂浓度
及组合的筛选，以找出合适的培养基组成物。
[0012]寻常大麻是一种臭名昭著的难以转殖的植物，由于其再生效率非常低(斯卢萨尔科维奇-加丽娜等人，2005.Acta Biol Cracov Ser Bot.47，145-151)。
[0013]基因组编辑是一种有前途的植物育种的新技术。使用称为CRISPR-Cas9突变的设计者核酸酶，可精确地针对任何感兴趣的基因。成功的基因组编辑需要简单的遗传学(二倍体)及高质量基因组DNA序列的可用性。编辑之后，应删除CRISPR-Cas基因，例如通过杂交并选择继承经诱导突变的空分离子。杂交不适用于诸如大麻的异型合子的作物，以无性繁殖方式进行繁殖。需要开发在叶片原生质体中短暂表达的方法。
[0014]其他的
技术介绍
包括：
[0015]Zhao等人，2017-Nature Plants.3(12)：956、
[0016]麦金农,L.、麦克杜格尔,G.、阿齐斯,N.及米拉姆,S(2001)“纤维大麻的转殖的进展”Annual Report of the Scottish Crop Research Institute 2000/2001,eds W H.麦克法兰史密斯及T.D.海尔布隆(丹地：SCRI因弗戈里),84-86、
[0017]美国专利申请公开第20120311744号。

技术实现思路

[0018]根据本专利技术的一些实施例的一方面提供一种体外繁殖大麻的方法，所述方法包括步骤：
[0019](a)在一固体培养基上培养包括一分生组织的一大麻植物部分，以获得一外植体；以及随后
[0020](b)使所述外植体经受一细胞壁破坏剂处理；
[0021](c)在一液体培养基中培养所述外植体；以及随后可选地，
[0022]其中步骤(a)至(c)进行1至n次，直至出现适合再生的叶片为止。
[0023]根据本专利技术的一些实施例，所述方法进一步包括：在步骤(a)之前对所述外植体进行灭菌。
[0024]根据本专利技术的一些实施例，所述液体培养基包括所述细胞壁破坏剂。
[0025]根据本专利技术的一些实施例，所述步骤(c)是在摇晃中进行。
[0026]根据本专利技术的一些实施例，所述步骤(a)是进行7至30天。
[0027]根据本专利技术的一些实施例，所述步骤(c)是进行5至30天。
[0028]根据本专利技术的一些实施例，所述分生组织是一顶端分生组织或一腋生分生组织。
[0029]根据本专利技术的一些实施例，包括所述分生组织的所述外植体是一茎的外植体。
[0030]根据本专利技术的一些实施例，所述外植体是来自一幼苗。
[0031]根据本专利技术的一些实施例，所述外植体是来自一成熟的植株。
[0032]根据本专利技术的一些实施例，所述方法进一步包括：在步骤(a)与(c)之间自所述外植体移除叶片以及坏死区域。
[0033]根据本专利技术的一些实施例，所述细胞壁破坏剂是选自由一化学药剂、一酵素及一物理性处理所组成的群组。
[0034]根据本专利技术的一些实施例，根据本专利技术的一些实施例，所述酵素包括多个酵素。
[0035]根据本专利技术的一些实施例，以一亚致死浓度提供所述酵素。
[0036]根据本专利技术的一些实施例，所述酵素是选自由果胶酶、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种体外繁殖大麻的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：(a)在一固体培养基上培养包括一分生组织的一大麻植物部分，以获得一外植体；以及随后(b)使所述外植体经受一细胞壁破坏剂处理；(c)在一液体培养基中培养所述外植体；以及随后可选地，其中步骤(a)至(c)进行1至n次，直至出现适合再生的叶片为止。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括：在步骤(a)之前对所述外植体进行灭菌。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述液体培养基包括所述细胞壁破坏剂。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(c)是在摇晃中进行。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(a)是进行7至30天。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(c)是进行5至30天。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于：所述分生组织是一顶端分生组织或一腋生分生组织。8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于：包括所述分生组织的所述外植体是一茎的外植体。9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于：所述外植体是来自一幼苗。10.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于：所述外植体是来自一成熟的植株。11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括：在步骤(a)与(c)之间自所述外植体移除叶片以及坏死区域。12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于：所述细胞壁破坏剂是选自由一化学药剂、一酵素及一物理性处理所组成的群组。13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述酵素包括多个酵素。14.如权利要求12至13中任一项所述的方法，其特征在于：以一亚致死浓度提供所述酵素。15.如权利要求12至14中任一项所述的方法，其特征在于：所述酵素是选自由果胶酶、角质酶及其组合所组成的群组。16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其特征在于：在所述步骤(a)中，所述固体培养基缺乏所述细胞壁破坏剂。17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其特征在于：所述出现适合再生的叶片是通过生根以及驯化来体现。18.一种由如权利要求1至17中任一项所述的方法所获得的可再生的大麻外植体。19.一种在一组织培养物中再生大麻的方法，其特征在于：所述方法包括：在一固体培养基上体外培养一可再生的大麻外植体，以再生大麻，其中所述固体培养基包括至少一再生剂以及一细胞壁破坏剂。20.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述可再生的大麻外植体是如权利要求18中所述的可再生的大麻外植体。21.一种体外转殖大麻的方法，其特征在于：所述方法包括：将一可再生的大麻外植体
与一多核苷酸及一细胞壁破坏剂体外接触，其中所述多核苷酸编码感兴趣的一表达产物。22.如权利要求21所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括：在接触之前，使叶片受伤。23.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其特征在于：所述体外可再生的大麻外植体是如权利要求18中所述的可再生的大麻外植体。24.如权利要求21至23中任一项所述的方法，其特征在于：所述转殖包括一短暂转殖。25.如权利要求21至23中任一项所述的方法，其特征在于：所述转殖包括一稳定转殖。26.如权利要求21至23中任一项所述的方法，其特征在于：所述接触是通过轰击法或农杆菌而实现的。27.一种在植物体中再生大麻的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：(a)移除、暴露及/或伤害一大麻组织的一分生组织，以获得一分生组织经耗尽的大麻组织；以及(b)利用一组合物处理所述分生组织经耗尽的大麻组织，所述组合物包括允许分生组织再生的至少一植物激素。28.一种在植物体中转殖大麻的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：(a)移除、暴露及/或伤害一大麻组织的一分生组织，以获得一分生组织经耗尽的大麻组织；以及(b)利用一组合物及另一组合物处理所述分生组织经耗尽的大麻组织，所述组合物包括允许分生组织再生的至少一植物激素，所述另一组合物包括一核酸序列，所述核酸序列编码感兴趣的一表达产物。29.如权利要求27至28中任一项所述的方法，其特征在于：包括所述允许植物再生的至少一植物激素的所述组合物以及包括所述感兴趣的核酸序列的所述另一组合物是相同的组合物。30.如权利要求27至28中任一项所述的方法，其特征在于：包括所述允许植物再生的至少一植物激素的所述组合物以及包括所述感兴趣的核酸序列的所述另一组合物是不同的组合物。31.如权利要求27至30中任一项所述的方法，其特征在于：同时以包括所述允许植物再生的至少一植物激素的所述组合物以及包括所述感兴趣的核酸序列的所述另...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫西，
申请(专利权)人：以色列国家农业部，农村发展农业研究组织，
类型：发明
国别省市：